ZFNs介导肝脏特异性表达外源基因hsfat-1在猪ROSA26位点整合与重构胚的制备

发布时间：2023-02-26 01:53

　　n-3多不饱和脂肪酸为人体必需脂肪酸,可降低多种疾病发生的凤险,n-3的不足及n-6/n-3比例失衡,不仅在发育阶段还在整个生命过程中对人体各代谢活动产生不良影响,但是由于人体内缺乏相应的酶类导致其合成量较少,必须依赖于食物摄入。线虫fat-1基因编码的脂肪酸去饱和酶,可将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸,调和机体n-6/n-3比例。因此,fat-1转基因动物将成为人类必需的n-3脂肪酸的重要来源。传统的转基因动物制备过程中由于目的基因整合位点随机性,不利于目的基因的表达及调控,具有安全隐患。本研究将新型的锌指核酸酶技术与传统的同源重组打靶技术相结合,实现hsfat-1基因在猪ROSA26位点的定点整合,提高了转基因动物的安全性。具体研究内容如下：1、本研究中将线虫fat-1基因按照哺乳动物密码子使用偏好性进行优化并制备哺乳动物表达载体,通过转染猪胎儿成纤维细胞及G418筛选得到阳性克隆,在阳性克隆细胞培养时添加脂肪酸去饱和酶作用底物花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA),通过GC-MS定细胞中各脂肪酸含量间接评估脂肪酸去饱和酶将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸能力。结果表明...

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 fat-1基因研究进展
    1.3 基因的定点整合研究进展
        1.3.1 整合位点选择
        1.3.2 目的基因座的定点切割
    1.4 目的基因的表达调控策略
    1.5 转基因动物制备方法
        1.5.1 DNA显微注射法
        1.5.2 慢转录病毒感染法
        1.5.3 精子载体法
        1.5.4 体细胞核移植
        1.5.5 转座子介导的基因转移
        1.5.6 诱导性多能干细胞
    1.6 转基因动物应用
        1.6.1 转基因动物生物反应器
        1.6.2 实验动物模型
        1.6.3 基因治疗
        1.6.4 改造生物、培育新的生物品种
        1.6.5 器官移植
    1.7 本研究的目的意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 主要组织样品
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器及耗材
        2.1.4 主要分析软件及数据库
    2.2 方法
        2.2.1 本研究的技术路线
        2.2.2 hsfat-1基因优化合成
        2.2.3 hsfat-1基因功能验证
        2.2.4 猪ROSA26定点切割锌指核酸酶(ZFNs)设计
        2.2.5 定点整合载体ROSA26-hsfat-1构建及验证
        2.2.6 细胞筛选及鉴定
        2.2.7 重构胚的制备与移植
3 结果
    3.1 hsfat-1基因优化合成
    3.2 hsfat-1基因功能验证
        3.2.1 pcDNA3.1(+)hsfat-1质粒提取及酶切鉴定
        3.2.2 pcDNA3.1(+)hsfat-1、pcDNA3.1(+)载体转染猪胎儿成纤维细胞
        3.2.3 hsfat-1阳性克隆去饱和酶功能验证
    3.3 猪ROSA26定点切割ZFNs预测结果
    3.4 定点整合载体ROSA26-hsfat-1构建及细胞筛选
        3.4.1 定点整合载体ROSA26-hsfat-1构建
        3.4.2 ROSA26-hsfat-1转基因细胞筛选
    3.5 重构胚的制备与移植
        3.5.1 重构胚的制备
        3.5.2 重构胚的移植
4 讨论
    4.1 关于hsfat-1基因编码的脂肪酸去饱和酶的活性
    4.2 关于本研究基因打靶效率的讨论
    4.3 单克隆细胞筛选的效率效率的问题
    4.4 关于筛选标记基因的去除
5 小结
    5.1 本研究结论
    5.2 本研究创新点与特色
    5.3 本研究不足点与下一步工作建议
参考文献
附录
致谢



本文编号：3749571