版纳微型猪近交系肌内脂肪沉积相关基因的功能验证
发布时间：2023-02-26 02:54
肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是影响肉品质性状的重要因素,与肉品质的嫩度、多汁和风味呈正相关。近三十年以来,品种改良和促生长营养措施在获得高瘦肉率和低背膘厚的同时,导致IMF含量大量减少,极大地降低了猪肉品质。如何在不降低猪生长性能和产肉量的前提下提高IMF含量,已成为动物科学领域研究者亟待研究和解决的重大科学问题。 本课题对版纳微型猪近交系心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein, H-FABP or FABP3)基因进行研究,分别从细胞和组织水平验证过表达FABP3与IMF含量及其他指标的关联性,并探索其可能的分子机制。为制备IMF含量丰富和肉品质性状优良的猪新品种提供科学依据。获得的主要研究成果有： 1.将FABP3分别插入pcDNA3、pIRES2-EGFP和piggyBac质粒,成功构建了真核表达载体pcDNA3-FABP3、pIRES2-EGFP-FABP3和PB[EGFP,FABP3]。将上述真核表达载体分别瞬时转染MDCK, BHK-21、HepG2、3T3-L1细胞,经western blot检测...
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 脂类代谢及其调控
1.1.1 脂肪组织概述
1.1.2 脂肪细胞分化及调控
1.1.3 脂肪沉积及调控
1.2 肌内脂肪研究进展
1.2.1 肌内脂肪的生成
1.2.2 肌内脂肪与肉品质的关系
1.2.3 营养因素对肌内脂肪含量的影响
1.3 肌内脂肪含量的遗传控制
1.3.1 脂肪酸结合蛋白概述
1.3.2 心脏脂肪酸结合蛋白结构
1.3.3 心脏脂肪酸结合蛋白功能
1.4 转基因动物制备方法
1.4.1 原核显微注射法
1.4.2 逆转录病毒载体法
1.4.3 精子介导的基因转移
1.4.4 胚胎干细胞法
1.4.5 体细胞核移植法
1.4.6 PiggyBac转座子
1.5 本研究的意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 实验动物和细胞
2.1.3 试剂盒
2.1.4 酶和Marker
2.1.5 抗体和引物
2.1.6 主要试剂和耗材
2.2 实验仪器设备
2.3 主要试剂的配制
2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备所需试剂的配制
2.3.2 质粒DNA提取所需试剂的配制
2.3.3 基因组DNA提取所需试剂的配制
2.3.4 总RNA提取所需试剂的配制
2.3.5 琼脂糖凝胶电泳所需试剂的配制
2.3.6 总蛋白质提取所需试剂的配制
2.3.7 SDS-PAGE所需试剂的配制
2.3.8 Western blot所需试剂的配制
2.3.9 细胞培养所需试剂的配制
2.3.10 3T3-L1小鼠前脂肪细胞诱导分化所需试剂的配制
2.3.11 油红O染色实验所需试剂的配制
2.3.12 组织切片所需试剂的配制
2.4 实验方法
2.4.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
2.4.2 质粒DNA的转化
2.4.3 质粒DNA的小量提取
2.4.4 质粒DNA的大量提取
2.4.5 普通PCR
2.4.6 高保真PCR
2.4.7 DNA的酶切
2.4.8 PCR和酶切产物的切胶回收
2.4.9 PCR和酶切产物的回收
2.4.10 DNA的连接及转化
2.4.11 In-Fusion实验
2.4.12 荧光定量PCR
2.4.13 3T3-L1小鼠前脂肪细胞培养及诱导分化
2.4.14 细胞培养及传代
2.4.15 细胞的冻存与复苏
2.4.16 细胞瞬时转染实验
2.4.17 细胞稳定转染实验
2.4.18 总RNA的提取
2.4.19 反转录合成cDNA
2.4.20 总蛋白的提取
2.4.21 Western blot实验
2.4.22 油红O染色
2.4.23 3T3-L1细胞甘油三酯含量的测定
2.4.24 显微注射法制备转基因小鼠
2.4.25 小鼠基因组DNA的提取
2.4.26 小鼠骨骼肌甘油三酯含量的测定
2.4.27 小鼠骨骼肌游离脂肪酸含量的测定
2.4.28 小鼠组织石蜡切片
2.4.29 小鼠骨骼肌冰冻切片
第三章 结果与分析
3.1 真核表达载体的构建
3.1.1 重组质粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的菌液PCR鉴定结果
3.1.2 重组质粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的酶切鉴定结果
3.1.3 重组质粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的测序鉴定结果
3.1.4 PiggyBac转座子重组质粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的菌液PCR结果
3.1.5 PiggyBac转座子重组质粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的酶切鉴定结果
3.1.6 PiggyBac转座子重组质粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的测序鉴定结果
3.1.7 其它真核表达载体的构建结果
3.2 转基因细胞系的建立及检测
3.2.1 细胞的培养
3.2.2 真核表达质粒瞬时转染细胞结果
3.2.3 小鼠前脂肪细胞稳定表达细胞株的筛选
3.2.4 稳定转染细胞株的RT-PCR检测
3.2.5 稳定转染细胞株的western blot检测
3.2.6 细胞诱导分化及油红O染色结果
3.2.7 细胞甘油三酯含量测定结果
3.2.8 FABP3上调对脂代谢相关基因表达的影响
3.3 转基因小鼠的制备
3.3.1 转座子表达质粒瞬时转染细胞结果
3.3.2 显微注射方法制备转基因小鼠
3.3.3 转基因小鼠基因组水平检测结果
3.3.4 转基因小鼠RT-PCR检测结果
3.3.5 转基因小鼠western blot检测结果
3.3.6 转基因小鼠活体成像结果
3.4 转基因小鼠相关指标的测定
3.4.1 转基因小鼠体重测量结果
3.4.2 转基因小鼠甘油三酯和游离脂肪酸测定结果
3.4.3 转基因小鼠骨骼肌冰冻切片结果
3.4.4 FABP3过表达对小鼠骨骼肌脂代谢的影响
3.4.5 FABP3过表达对肝脏脂代谢的影响
3.5 讨论与展望
第四章 结论
参考文献
致谢
附录
作者简历
本文编号：3749668
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 脂类代谢及其调控
1.1.1 脂肪组织概述
1.1.2 脂肪细胞分化及调控
1.1.3 脂肪沉积及调控
1.2 肌内脂肪研究进展
1.2.1 肌内脂肪的生成
1.2.2 肌内脂肪与肉品质的关系
1.2.3 营养因素对肌内脂肪含量的影响
1.3 肌内脂肪含量的遗传控制
1.3.1 脂肪酸结合蛋白概述
1.3.2 心脏脂肪酸结合蛋白结构
1.3.3 心脏脂肪酸结合蛋白功能
1.4 转基因动物制备方法
1.4.1 原核显微注射法
1.4.2 逆转录病毒载体法
1.4.3 精子介导的基因转移
1.4.4 胚胎干细胞法
1.4.5 体细胞核移植法
1.4.6 PiggyBac转座子
1.5 本研究的意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 实验动物和细胞
2.1.3 试剂盒
2.1.4 酶和Marker
2.1.5 抗体和引物
2.1.6 主要试剂和耗材
2.2 实验仪器设备
2.3 主要试剂的配制
2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备所需试剂的配制
2.3.2 质粒DNA提取所需试剂的配制
2.3.3 基因组DNA提取所需试剂的配制
2.3.4 总RNA提取所需试剂的配制
2.3.5 琼脂糖凝胶电泳所需试剂的配制
2.3.6 总蛋白质提取所需试剂的配制
2.3.7 SDS-PAGE所需试剂的配制
2.3.8 Western blot所需试剂的配制
2.3.9 细胞培养所需试剂的配制
2.3.10 3T3-L1小鼠前脂肪细胞诱导分化所需试剂的配制
2.3.11 油红O染色实验所需试剂的配制
2.3.12 组织切片所需试剂的配制
2.4 实验方法
2.4.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
2.4.2 质粒DNA的转化
2.4.3 质粒DNA的小量提取
2.4.4 质粒DNA的大量提取
2.4.5 普通PCR
2.4.6 高保真PCR
2.4.7 DNA的酶切
2.4.8 PCR和酶切产物的切胶回收
2.4.9 PCR和酶切产物的回收
2.4.10 DNA的连接及转化
2.4.11 In-Fusion实验
2.4.12 荧光定量PCR
2.4.13 3T3-L1小鼠前脂肪细胞培养及诱导分化
2.4.14 细胞培养及传代
2.4.15 细胞的冻存与复苏
2.4.16 细胞瞬时转染实验
2.4.17 细胞稳定转染实验
2.4.18 总RNA的提取
2.4.19 反转录合成cDNA
2.4.20 总蛋白的提取
2.4.21 Western blot实验
2.4.22 油红O染色
2.4.23 3T3-L1细胞甘油三酯含量的测定
2.4.24 显微注射法制备转基因小鼠
2.4.25 小鼠基因组DNA的提取
2.4.26 小鼠骨骼肌甘油三酯含量的测定
2.4.27 小鼠骨骼肌游离脂肪酸含量的测定
2.4.28 小鼠组织石蜡切片
2.4.29 小鼠骨骼肌冰冻切片
第三章 结果与分析
3.1 真核表达载体的构建
3.1.1 重组质粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的菌液PCR鉴定结果
3.1.2 重组质粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的酶切鉴定结果
3.1.3 重组质粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的测序鉴定结果
3.1.4 PiggyBac转座子重组质粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的菌液PCR结果
3.1.5 PiggyBac转座子重组质粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的酶切鉴定结果
3.1.6 PiggyBac转座子重组质粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的测序鉴定结果
3.1.7 其它真核表达载体的构建结果
3.2 转基因细胞系的建立及检测
3.2.1 细胞的培养
3.2.2 真核表达质粒瞬时转染细胞结果
3.2.3 小鼠前脂肪细胞稳定表达细胞株的筛选
3.2.4 稳定转染细胞株的RT-PCR检测
3.2.5 稳定转染细胞株的western blot检测
3.2.6 细胞诱导分化及油红O染色结果
3.2.7 细胞甘油三酯含量测定结果
3.2.8 FABP3上调对脂代谢相关基因表达的影响
3.3 转基因小鼠的制备
3.3.1 转座子表达质粒瞬时转染细胞结果
3.3.2 显微注射方法制备转基因小鼠
3.3.3 转基因小鼠基因组水平检测结果
3.3.4 转基因小鼠RT-PCR检测结果
3.3.5 转基因小鼠western blot检测结果
3.3.6 转基因小鼠活体成像结果
3.4 转基因小鼠相关指标的测定
3.4.1 转基因小鼠体重测量结果
3.4.2 转基因小鼠甘油三酯和游离脂肪酸测定结果
3.4.3 转基因小鼠骨骼肌冰冻切片结果
3.4.4 FABP3过表达对小鼠骨骼肌脂代谢的影响
3.4.5 FABP3过表达对肝脏脂代谢的影响
3.5 讨论与展望
第四章 结论
参考文献
致谢
附录
作者简历
本文编号：3749668
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