单核细胞增多性李斯特菌Lmo0964蛋白功能研究
发布时间：2023-02-26 05:42
单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是革兰氏阳性菌无芽胞杆菌，同时也是重要的人兽共患食源性病原菌，可引发胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等临床症状。在革兰氏阳性菌中，LPXTG锚定蛋白、毒素蛋白、菌毛和鞭毛形成相关蛋白都是通过二硫键形成蛋白系统（Dsb）中的DsbA修饰后才能通过Sec分泌系统实现跨膜转运。但是单增李斯特菌没有DsbA，只有Lmo0964和Lmo1059在基因组中被注释为DsbA-like蛋白。那么，单增李斯特菌是如何通过Lmo0964和SecY实现蛋白的跨膜转运的呢？首先，我们通过原核表达系统，成功的在大肠杆菌中诱导表达了单增李斯特菌的SecY（Lmo2612）和Lmo0964蛋白，表达量分别为0.2mg/ml、10mg/ml。我们利用新西兰白兔成功的制备了SecY和Lmo0964的抗体，经Western blot检测，抗体效价均为1：1000以上，其中SecY在PVDF膜上呈现单一的条带，这说明制备的抗体具有较高的特异性。利用蛋白酶K进行的蛋白定位实验表明：与革兰氏阴性菌的DsbA不同，单增李斯特菌的Lmo0964为胞内蛋白。为了进一步...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 李斯特菌介绍
1.1.1 李斯特菌简介
1.1.2 单核细胞增多性李斯特菌的致病力
1.1.3 单增李斯特菌的致病机制及主要毒力因子
1.2 李斯特菌的 SecY 系统研究进展
1.3 李斯特菌的 DsbA 蛋白研究进展
1.3.1 二硫键的形成
1.3.2 Dsb 家族蛋白
1.3.3 DsbA 蛋白
1.3.4 Lmo0964 蛋白
第二章 单增李斯特菌 SecY 蛋白的原核表达、纯化和抗体制备
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 Lm EGDe 细菌的培养
2.2.2 Lm EGDe 基因组 DNA 的提取
2.2.3 引物的设计与合成
2.2.4 PCR 扩增 secY 基因
2.2.5 PCR 产物的回收
2.2.6 SecY 蛋白的原核表达载体的构建与鉴定
2.2.7 SecY 蛋白的诱导表达、纯化
2.2.8 将制备好的抗体进行 Western blot 分析
2.3 实验结果
2.3.1 EGDe secY 基因片段的 PCR 扩增
2.3.2 重组质粒 pSL032 的鉴定
2.3.3 SecY 蛋白的表达纯化，抗体制备，及 Western blot 分析
2.4 讨论
第三章 单增李斯特菌 Lmo0964 蛋白的原核表达、纯化和抗体制备
3.1 实验材料
3.1.1 菌种及质粒
3.1.2 主要工具酶及试剂
3.1.3 主要实验仪器详见 2.1.3
3.1.4 主要试剂及配制详见 2.1.4
3.2 实验方法
3.2.1 Lm EGDe 细菌的培养
3.2.2 Lm EGDe 基因组 DNA 的提取详见 2.2.2.1
3.2.3 引物的设计与合成
3.2.4 PCR 扩增 Lm EGDe lmo0964 基因
3.2.5 PCR 产物的回收
3.2.6 lmo0964 基因的原核表达载体的构建与鉴定
3.2.7 Lmo0964 蛋白的诱导表达、纯化
3.2.8 蛋白复性(透析法)
3.2.9 送上海生工制备Lmo0964蛋白抗体进行Western blot 分析
3.3 结果分析
3.3.1 EGDe lmo0964 基因片段的 PCR 扩增
3.3.2 重组表达载体的构建与鉴定
3.3.3 Lmo0964 蛋白的表达纯化，抗体制备
3.4 讨论
第四章 单核细胞增多性李斯特菌 lmo0964 基因的敲除
4.1 单核细胞增多性李斯特菌基因敲除的原理
4.2 实验材料
4.2.1 菌种及质粒
4.2.2 试剂
4.2.3 试剂配制
4.2.4 引物的设计与合成
4.3 实验方法
4.3.1 缺失质粒的构建过程
4.3.2 回复突变株的构建
4.3.3 用 Lmo0964 蛋白抗体对单增李斯特菌 EGDe 突变株的 Western blot 分析
4.4 实验结果
4.4.1 上游同源臂和下游同源臂的扩增及拼接
4.4.2 目的片段与 pKSV7 载体的连接
4.4.3 同源重组菌的筛选与鉴定
4.4.4 回补株的构建
4.4.5 用 Lmo0964 蛋白抗体对单增李斯特菌 EGDe wt，突变株，回复突
4.5 讨论
第五章 lmo0964 基因缺失株的表型分析及蛋白定位
5.1 实验材料
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 试剂
5.2 实验方法
5.2.1 运动性试验
5.2.2 生长曲线测定
5.2.3 H2O2应激实验
5.2.4 蛋白酶 K 的方法分离膜蛋白与胞浆蛋白
5.2.5 细胞感染实验
5.3 实验结果
5.3.1 单核细胞增多性李斯特菌运动性实验
5.3.2 生长曲线表型
5.3.3 抗过氧化氢应激实验
5.3.4 蛋白酶 K 法分离膜蛋白与胞浆蛋白
5.3.5 细胞的侵袭及胞内感染实验
5.4 讨论
全文总结
参考文献
个人简介
致谢
本文编号：3749937
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 李斯特菌介绍
1.1.1 李斯特菌简介
1.1.2 单核细胞增多性李斯特菌的致病力
1.1.3 单增李斯特菌的致病机制及主要毒力因子
1.2 李斯特菌的 SecY 系统研究进展
1.3 李斯特菌的 DsbA 蛋白研究进展
1.3.1 二硫键的形成
1.3.2 Dsb 家族蛋白
1.3.3 DsbA 蛋白
1.3.4 Lmo0964 蛋白
第二章 单增李斯特菌 SecY 蛋白的原核表达、纯化和抗体制备
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 Lm EGDe 细菌的培养
2.2.2 Lm EGDe 基因组 DNA 的提取
2.2.3 引物的设计与合成
2.2.4 PCR 扩增 secY 基因
2.2.5 PCR 产物的回收
2.2.6 SecY 蛋白的原核表达载体的构建与鉴定
2.2.7 SecY 蛋白的诱导表达、纯化
2.2.8 将制备好的抗体进行 Western blot 分析
2.3 实验结果
2.3.1 EGDe secY 基因片段的 PCR 扩增
2.3.2 重组质粒 pSL032 的鉴定
2.3.3 SecY 蛋白的表达纯化，抗体制备，及 Western blot 分析
2.4 讨论
第三章 单增李斯特菌 Lmo0964 蛋白的原核表达、纯化和抗体制备
3.1 实验材料
3.1.1 菌种及质粒
3.1.2 主要工具酶及试剂
3.1.3 主要实验仪器详见 2.1.3
3.1.4 主要试剂及配制详见 2.1.4
3.2 实验方法
3.2.1 Lm EGDe 细菌的培养
3.2.2 Lm EGDe 基因组 DNA 的提取详见 2.2.2.1
3.2.3 引物的设计与合成
3.2.4 PCR 扩增 Lm EGDe lmo0964 基因
3.2.5 PCR 产物的回收
3.2.6 lmo0964 基因的原核表达载体的构建与鉴定
3.2.7 Lmo0964 蛋白的诱导表达、纯化
3.2.8 蛋白复性(透析法)
3.2.9 送上海生工制备Lmo0964蛋白抗体进行Western blot 分析
3.3 结果分析
3.3.1 EGDe lmo0964 基因片段的 PCR 扩增
3.3.2 重组表达载体的构建与鉴定
3.3.3 Lmo0964 蛋白的表达纯化，抗体制备
3.4 讨论
第四章 单核细胞增多性李斯特菌 lmo0964 基因的敲除
4.1 单核细胞增多性李斯特菌基因敲除的原理
4.2 实验材料
4.2.1 菌种及质粒
4.2.2 试剂
4.2.3 试剂配制
4.2.4 引物的设计与合成
4.3 实验方法
4.3.1 缺失质粒的构建过程
4.3.2 回复突变株的构建
4.3.3 用 Lmo0964 蛋白抗体对单增李斯特菌 EGDe 突变株的 Western blot 分析
4.4 实验结果
4.4.1 上游同源臂和下游同源臂的扩增及拼接
4.4.2 目的片段与 pKSV7 载体的连接
4.4.3 同源重组菌的筛选与鉴定
4.4.4 回补株的构建
4.4.5 用 Lmo0964 蛋白抗体对单增李斯特菌 EGDe wt，突变株，回复突
4.5 讨论
第五章 lmo0964 基因缺失株的表型分析及蛋白定位
5.1 实验材料
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 试剂
5.2 实验方法
5.2.1 运动性试验
5.2.2 生长曲线测定
5.2.3 H2O2应激实验
5.2.4 蛋白酶 K 的方法分离膜蛋白与胞浆蛋白
5.2.5 细胞感染实验
5.3 实验结果
5.3.1 单核细胞增多性李斯特菌运动性实验
5.3.2 生长曲线表型
5.3.3 抗过氧化氢应激实验
5.3.4 蛋白酶 K 法分离膜蛋白与胞浆蛋白
5.3.5 细胞的侵袭及胞内感染实验
5.4 讨论
全文总结
参考文献
个人简介
致谢
本文编号：3749937
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3749937.html
