TUDCA处理供体细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响

发布时间：2017-05-18 08:01

  本文关键词：TUDCA处理供体细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：供体细胞血清饥饿处理被认为是体细胞核移植技术成功的一个重要步骤,通过血清饥饿可以使大部分供体细胞停滞在G0/G1期,提高了其在核移植后卵胞质中重编程和发育能力。但突然除去培养液中的血清,培养的细胞处于逆境,容易使其产生应激反应,从而增加了细胞损伤的几率。牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)是一种抑制内质网应激的小分子物质。本研究在血清饥饿的牛胎儿成纤维细胞中添加TUDCA,减少因血清饥饿而引起的应激反应,研究其对克隆胚发育的影响,主要研究结果如下:1、用0、50、100、150、200μM TUDC A处理牛胎儿成纤维细胞后,通过对内质网应激相关表达基因GRP78和CHOP的检测,筛选合适的处理浓度。研究显示100μM TUDCA处理GRP78和C HOP表达量显著低于其他各组(P0.05),表明100μM TUDCA是处理最适浓度。2、采用100μM TUDCA处理血清饥饿的牛胎儿成纤维细胞,检测其对细胞生长状态、凋亡基因表达和重编程相关基因的影响。结果说明,TUDCA处理组可以降低细胞凋亡率(1.1±0.2%vs 6.4±0.4%,P0.05),对细胞周期影响无差异;同时凋亡相关基因P53和BAX的表达显著下降(P0.05);表观修饰基因HDAC1和DNMT1的表达也显著下降(P0.05),TUDCA处理的牛胎儿成纤维细胞中H3K9Ac水平是对照组的2.3倍(P0.05)。3、TUDCA处理的牛胎儿成纤维细胞用作体细胞核移植的供体细胞。结果显示,核移植后,TUDCA处理与对照组相比,胚胎融合率(78.46%vs 68.89%,P0.05);卵裂率(92.09%vs 86.56%,P0.05);和囊胚率(37.87%vs 30.43%,P0.05)都显著提高;同时囊胚中P53、HDAC1、DNMT1的表达水平也显著低于对照组(P0.05)。囊胚细胞凋亡率也显著降低(P0.05)。综上所述,100μM TUDCA处理成纤维细胞,可以减少血清饥饿供体细胞的应激反应,作为供体细胞有利于克隆胚的发育。
【关键词】：内质网应激 胎儿成纤维细胞 牛磺熊脱氧胆酸 体细胞核移植 牛
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 文献综述11-23
• 第一章 内质网应激与TUDCA的研究概况11-15
• 1.1 内质网应激机制11-13
• 1.1.1 PERK途径11-12
• 1.1.2 IRE1途径12
• 1.1.3 ATF6途径12-13
• 1.2 内质网应激在卵母细胞及早期胚胎中的研究13-14
• 1.3 牛磺熊脱氧胆酸14-15
• 第二章 体细胞核移植15-23
• 2.1 克隆胚核重构15-16
• 2.2 DNA甲基化与重编程16-18
• 2.3 组蛋白与重编程18
• 2.4 X染色体失活与重编程18-19
• 2.5 提高体细胞核移植效率的方法19-23
• 2.5.1 供体细胞选择19-20
• 2.5.2 受体卵母细胞处理20
• 2.5.3 卵母细胞激活20-21
• 2.5.4 供体细胞和克隆胚胎的药物处理21-23
• 实验部分23-43
• 第三章 TUDCA对血清饥饿处理牛胎儿成纤维细胞的影响23-34
• 3.1 材料和设备23-24
• 3.1.1 仪器设备和耗材23-24
• 3.1.2 试剂和配制方法24
• 3.2 实验方法24-28
• 3.2.1 原代牛皮肤成纤维细胞的培养24
• 3.2.2 细胞的传代培养24-25
• 3.2.3 细胞RNA的提取及反转录25
• 3.2.4 实时荧光定量PCR检测25-27
• 3.2.5 细胞周期和凋亡检测27
• 3.2.6 成纤维细胞的H3K9ac染色27
• 3.2.7 定量荧光强度27-28
• 3.2.8 实验数据的统计分析28
• 3.3 实验结果28-31
• 3.3.1 不同浓度TUDCA对细胞内质网应激相关基因表达的影响28
• 3.3.2 TUDCA对牛成纤维细胞周期和凋亡的影响28-29
• 3.3.4 凋亡相关基因在成纤维细胞中表达29-30
• 3.3.5 100μM TUDCA处理对DNMT1和HDAC1表达的影响30
• 3.3.6 100μM TUDCA对成纤维细胞H3K9ac水平的影响30-31
• 3.4 讨论31-33
• 3.5 小结33-34
• 第四章 TUDCA处理供体细胞对牛体细胞核移植 早期胚胎发育的影响34-43
• 4.1 实验材料34-35
• 4.1.1 仪器设备34-35
• 4.1.2 耗材、试剂和配方35
• 4.2 实验方法35-37
• 4.2.1 供体细胞的准备35
• 4.2.2 卵母细胞的收集和体外成熟(IVM)培养35-36
• 4.2.3 体细胞核移植、融合、激活和胚胎培养36
• 4.2.4 实时荧光定量PCR检测36-37
• 4.2.5 囊胚的凋亡染色37
• 4.2.6 实验数据统计分析37
• 4.3 实验结果37-41
• 4.3.1 TUDCA对克隆胚体外发育的影响37-39
• 4.3.2 TUDCA对体细胞核移植胚胎重编程的影响39
• 4.3.3 TUDCA对克隆胚凋亡率的影响39-41
• 4.4 讨论41-42
• 4.5 小结42-43
• 全文结论43-44
• 参考文献44-52
• 致谢52-53
• 作者简介53

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