2012～2013年黑龙江省猪流行性腹泻病毒主要结构基因的遗传变异分析
发布时间：2023-03-05 19:57
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是冠状病毒成员,可导致各种年龄的猪发生呕吐、水样腹泻以致脱水死亡,新生仔猪的发病率和死亡率可达100%。该病在全球范围内分布很广,给世界的养猪业带来非常严重的经济损失。 从2010年,我国许多省份的猪场相继发生了严重的腹泻(疑似病毒性腹泻),发病率和死亡率都极高,黑龙江省各地免疫过的猪场也难以幸免。鉴于此,本实验室于2012年3月～2012年12月收集白黑龙江省和l内蒙占自治区猪场共10份发生严重腹泻的仔猪小肠及粪便样品,通过RT-PCR法确定了病原,其中9份为PEDV单独感染,1份与猪轮状病毒混合感染,无TGEV感染情况。结果表明黑龙江省腹泻病原中,PEDV主导。 本研究通过RT-PCR法克隆了10株PEDV S1区基因以及其中HLJ-2012株的结构基因及ORF3基因,分别克隆到pMD18-T载体上,筛选出阳性重组子进行序列的测定,并与参考毒株进行序列比较、分析,构建系统发育树,分析本实验中的流行毒株与参考毒株的遗传变异情况和系统发育关系。10株PEDV SI区基因均由2376个核苷酸组成...
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 猪流行性腹泻的概述
1.2 PEDV的生物学特征
1.2.1 PEDV的分类地位及生物学特征
1.2.2 PEDV基因组及其各段编码蛋白功能
1.2.3 开放阅读框3(ORF3)及其编码的SNE蛋白
1.3 猪流行性腹泻病毒体内外感染的特性
1.3.1 体内致病性
1.3.2 体外培养特征
1.4 PED免疫学研究概况
1.4.1 PEDV感染仔猪后的免疫反应
1.4.2 PEDV感染后的抗体产生及其保护作用
1.4.3 PED的疫苗研究
1.5 PED诊断方法的研究进展
1.5.1 免疫电镜法
1.5.2 免疫荧光法
1.5.3 微量血清中和试验
1.5.4 ELISA法
1.5.5 RT-PCR法
1.6 本研究的目的与意义
2 材料及方法
2.1 实验材料
2.1.1 猪小肠和粪便病料
2.1.2 细胞与病毒
2.1.3 菌种
2.1.4 实验动物
2.1.5 引物
2.1.6 细胞培养液及分子生物学试剂
2.1.7 主要仪器设备
2.1.8 试验用缓冲液及培养基
2.2 实验方法
2.2.1 PEDV序列的测定
2.2.2 PEDV HLJ-2012株兔源抗体对LJB/03株的中和试验
2.2.3 PEDV HLJ-2012株的分离培养
3 结果与分析
3.1 PEDV流行毒株S基因S1区的扩增
3.2 病毒S基因S1区的克隆和序列分析
3.3 基于S基因S1区的遗传演化关系
3.4 HLJ-2012株结构基因、ORF3基因分子鉴定及遗传变异分析
3.4.1 PEDV HLJ-2012株S、E、M、N及ORF3基因的扩增
3.4.2 S、E、M、N及ORF3基因的克隆及序列测定
3.4.3 S基因序列分析及S蛋白抗原区域、抗原表位分析
3.4.4 N基因序列分析
3.4.5 M和E基因的序列分析
3.4.6 ORF3的序列分析
3.4.7 基于S基因的遗传演化关系
3.4.8 基于N、M、E基因的遗传演化关系
3.5 LJB/03株TCID50的测定结果
3.6 N蛋白表达并纯化
3.7 间接ELISA检测家兔体内抗体水平
3.8 中和试验检测抗体水平
3.9 病毒HLJ-2012株在vero细胞上的培养
3.10 间接免疫荧光检测结果
3.11 直接负染电镜法观察病毒结果
3.12 间接ELISA检测结果
3.13 RT-PCR检测的结果
3.14 原始毒与传代毒M基因部分片段的分析结果
3.15 HLJ-2012分离毒TCID50的测定结果
4 讨论
4.1 病料检测结果及病毒遗传变异情况
4.2 基于S基因的序列分析及进化树分析
4.3 关于N基因的序列分析
4.4 关于M基因的序列分析
4.5 关于E基因的序列分析
4.6 关于ORF3的序列分析
4.7 关于HLJ-2012株兔源抗体对LJB/03株的中和试验的分析
4.8 PEDV HLJ-2012株在vero细胞上的分离培养
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3756820
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 猪流行性腹泻的概述
1.2 PEDV的生物学特征
1.2.1 PEDV的分类地位及生物学特征
1.2.2 PEDV基因组及其各段编码蛋白功能
1.2.3 开放阅读框3(ORF3)及其编码的SNE蛋白
1.3 猪流行性腹泻病毒体内外感染的特性
1.3.1 体内致病性
1.3.2 体外培养特征
1.4 PED免疫学研究概况
1.4.1 PEDV感染仔猪后的免疫反应
1.4.2 PEDV感染后的抗体产生及其保护作用
1.4.3 PED的疫苗研究
1.5 PED诊断方法的研究进展
1.5.1 免疫电镜法
1.5.2 免疫荧光法
1.5.3 微量血清中和试验
1.5.4 ELISA法
1.5.5 RT-PCR法
1.6 本研究的目的与意义
2 材料及方法
2.1 实验材料
2.1.1 猪小肠和粪便病料
2.1.2 细胞与病毒
2.1.3 菌种
2.1.4 实验动物
2.1.5 引物
2.1.6 细胞培养液及分子生物学试剂
2.1.7 主要仪器设备
2.1.8 试验用缓冲液及培养基
2.2 实验方法
2.2.1 PEDV序列的测定
2.2.2 PEDV HLJ-2012株兔源抗体对LJB/03株的中和试验
2.2.3 PEDV HLJ-2012株的分离培养
3 结果与分析
3.1 PEDV流行毒株S基因S1区的扩增
3.2 病毒S基因S1区的克隆和序列分析
3.3 基于S基因S1区的遗传演化关系
3.4 HLJ-2012株结构基因、ORF3基因分子鉴定及遗传变异分析
3.4.1 PEDV HLJ-2012株S、E、M、N及ORF3基因的扩增
3.4.2 S、E、M、N及ORF3基因的克隆及序列测定
3.4.3 S基因序列分析及S蛋白抗原区域、抗原表位分析
3.4.4 N基因序列分析
3.4.5 M和E基因的序列分析
3.4.6 ORF3的序列分析
3.4.7 基于S基因的遗传演化关系
3.4.8 基于N、M、E基因的遗传演化关系
3.5 LJB/03株TCID50的测定结果
3.6 N蛋白表达并纯化
3.7 间接ELISA检测家兔体内抗体水平
3.8 中和试验检测抗体水平
3.9 病毒HLJ-2012株在vero细胞上的培养
3.10 间接免疫荧光检测结果
3.11 直接负染电镜法观察病毒结果
3.12 间接ELISA检测结果
3.13 RT-PCR检测的结果
3.14 原始毒与传代毒M基因部分片段的分析结果
3.15 HLJ-2012分离毒TCID50的测定结果
4 讨论
4.1 病料检测结果及病毒遗传变异情况
4.2 基于S基因的序列分析及进化树分析
4.3 关于N基因的序列分析
4.4 关于M基因的序列分析
4.5 关于E基因的序列分析
4.6 关于ORF3的序列分析
4.7 关于HLJ-2012株兔源抗体对LJB/03株的中和试验的分析
4.8 PEDV HLJ-2012株在vero细胞上的分离培养
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3756820
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3756820.html
