SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α通路在氧化应激介导的奶牛肝脂沉积中的作用

发布时间：2023-03-14 17:42

　　目的本试验以围产期脂肪肝奶牛和体外奶牛脂肪肝细胞模型为研究对象,运用腺病毒转染技术过表达SIRT1基因,研究SIRT1对奶牛肝细胞氧化应激状态、SIRT1基因和蛋白表达水平及下游脂代谢相关蛋白和关键酶表达水平和活性及肝脂沉积的影响,明确SIRT1在奶牛脂肪肝病发生中的作用机制,为阐明奶牛脂肪肝的发病机制和寻找治疗靶点奠定理论和实验基础。方法选取12头奶牛,颈静脉采集血液分离出血清,常规方法处死后无菌采集肝脏组织样品,经检测血清和肝脏组织TG含量,筛选出6头为对照奶牛、6头为脂肪肝奶牛。采用改良胶原酶两步灌流法分离培养新生犊牛肝细胞,添加不同浓度OA溶液(0、0.25、0.5、0.75 m M)作用不同时间点确定最佳体外奶牛脂肪肝细胞模型OA添加浓度和时间。体外培养奶牛脂肪肝细胞到最佳生长状态,一部分添加NEFAs、NAC、NEFAs+NAC处理细胞肝细胞,另一部分转染适量过表达SIRT1腺病毒,于肝细胞培养结束收集细胞。采用生化分析仪检测脂代谢指标;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清和肝脏组织中氧化抗氧化指标;采用免疫荧光技术确定最佳重组腺病毒添加量;采用实时荧光定量PCR(q ...

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致谢
摘要
ABSTRACT
缩写和符号清单
文献综述
引言
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 试验动物
        1.1.2 实验主要材料
        1.1.3 主要仪器
    1.2 试验方法
        1.2.1 溶液配制
        1.2.2 腺病毒构建
        1.2.3 体内试验样品采集
        1.2.4 原代肝细胞的分离培养
        1.2.5 最佳添加浓度和时间
        1.2.6 试验分组及处理
        1.2.7 组织学的检测
        1.2.8 血液、肝脏组织中生化指标检测
        1.2.9 ELISA法检测氧化抗氧化指标及SIRT1酶活性
        1.2.10 荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α信号通路关键因子mRNA的相对表达量
        1.2.11 Westernblot法测定SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α信号通路相关蛋白的表达
        1.2.12 免疫荧光(IF)检测腺病毒转染过表达SIRT1基因的蛋白表达
        1.2.13 数据统计分析
2 结果与分析
    2.1 脂肪肝奶牛血液、肝脏中脂代谢功能紊乱
        2.1.1 围产期对照奶牛和脂肪肝奶牛肝脏组织学检测
        2.1.2 围产期对照奶牛和脂肪肝奶牛血液生化指标变化
        2.1.3 围产期对照奶牛和脂肪肝奶牛血清、肝脏氧化抗氧化指标变化
        2.1.4 围产期对照奶牛和脂肪肝奶牛肝脏脂代谢指标变化
        2.1.5 围产期对照奶牛和脂肪肝奶牛肝脏组织中SIRT1通路的变化
    2.2 过表达SIRT1腺病毒对肝细胞脂代谢的影响
        2.2.1 体外肝细胞形态学观察
        2.2.2 添加OA高脂造模最佳浓度的筛选
        2.2.3 过表达SIRT1腺病毒载体的成功构建的鉴定
        2.2.4 腺病毒转染肝细胞最佳浓度的筛选
        2.2.5 OA造模脂沉积对肝细胞SIRT1、脂代谢和氧化应激关键分子表达的影响
        2.2.6 添加NEFAs对造模高脂肝细胞脂代谢和SIRT1通路的影响
        2.2.7 转染过表达SIRT1腺病毒在氧化应激介导的奶牛肝细胞中脂质沉积的作用机制
3 讨论
    3.1 肝脂沉积对SIRT1、脂代谢和氧化应激关键分子表达和酶活的影响
    3.2 氧化应激对SIRT1和脂代谢关键分子表达和酶活及肝脂沉积的影响
    3.3 过表达奶牛肝细胞SIRT1对脂代谢和氧化应激关键分子表达和酶活的影响
4 结论
参考文献
作者简介



本文编号：3762454