截短表达B2L蛋白及羊口疮病毒间接ELISA方法的建立

发布时间：2023-03-19 23:09

　　羊口疮,又名羊传染性脓疱病(Contagious Ecthyma),是痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)中的羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)所引起的一种接触传染性疾病。使用DNAstar软件中Protean功能对GenBank上发表的羊口疮病毒表面囊膜蛋白B2L基因序列进行分析,将B2L基因全长命名为B2L-1,筛选出高度亲水的优势表位区命名为B2L-2。对B2L-1、B2L-2编码基因进行大肠杆菌偏爱性密码子优化,通过基因合成手段,将His-tag及B2L-1、B2L-2基因分别连接到pET32a(+)载体上,构建成原核表达载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞中,进行原核表达,并优化了表达条件,后通过Ni-NTAAgarose亲和纯化柱进行纯化。将B2L-1、B2L-2蛋白分别免疫羔羊,以获得阳性血清,并将纯化的重组融合蛋白用作包被抗原,建立检测羊口疮病毒抗体的间接ELISA方法,优化了 ELISA条件。SDS-PAGE结果表明,成功获得了具有良好可溶性和高表达效率的重组融合蛋白B2L-1和截短的B2L-2蛋白;Western Bol...

【文章页数】：47 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 羊口疮综述
        1.1.1 病毒特征
        1.1.2 基因结构
        1.1.3 主要的基因简介
        1.1.4 流行病学
        1.1.5 感染机制
        1.1.6 免疫特性
        1.1.7 免疫逃避策略
        1.1.8 临床症状
        1.1.9 病理组织学变化
        1.1.10 诊断方法
        1.1.11 研究进展
    1.2 B2L基因密码子优化及截短
        1.2.1 密码子优化概念
        1.2.2 密码子影响蛋白表达条件
    1.3 研究意义与目的
2 材料和方法
    2.1 材料
    2.2 方法
        2.2.1 密码子优化及截短
        2.2.2 重组蛋白表达
        2.2.3 重组蛋白纯化
        2.2.4 重组蛋白Western Blot鉴定
        2.2.5 重组蛋白琼脂扩散实验
        2.2.6 基于B2L-1、B2L-2抗原的间接ELISA检测方法的建立
        2.2.7 中和试验检验
3 结果与分析
    3.1 B2L基因截短与命名
    3.2 B2L-1、B2L-2蛋白原核表达结果
    3.3 B2L-1、B2L-2蛋白纯化SDS-PAGE结果
    3.4 B2L-1、B2L-2 Western Blot结果
    3.5 B2L-1、B2L-2蛋白琼脂扩散实验
    3.6 最佳蛋白包被量和一抗最佳稀释度的确定
    3.7 最佳封闭液及最佳二抗稀释度的确定
    3.8 最佳底物显色时间的确定
    3.9 临界值的确定
    3.10 敏感性试验
    3.11 批内试验和批间试验
    3.12 中和试验结果
    3.13 ELISA方法检测结果与中和试验结果对比
4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3766176