Myostatin基因突变表达载体的构建及其免疫效果的研究

发布时间：2023-03-22 08:47

　　Myostatin,肌肉生长发育的负调控因子,是一种分泌型糖蛋白,主要在动物的骨骼肌中特异性表达。研究发现,Myostatin基因超量表达可以导致动物的肌肉萎缩；而Myostatin基因的突变可以使动物产生双肌现象。因此,利用Myostatin基因突变体构建基因疫苗并研究其对畜禽肌肉生长发育的影响,不仅可以从理论上发现Myostatin发挥作用的重要位点,而且可以从实践上探讨提高肉产量和肉品质的新途径。 本试验根据NCBI上已有的猪、绵羊Myostatin序列(登录号分别为NM₂14435, NM₀01009428.1)设计引物,利用RT-PCR从猪、绵羊骨骼肌RNA中扩增猪、绵羊Myostatin1128bp的CDS区序列,并连接至pEASY-T3载体,命名为pEASY-T3-MSTN,进一步在起始密码子ATG前添加Kozak序列(GCC ACC),再次克隆至pEASY-T3载体。然后亚克隆至pVAX真核表达载体,命名为猪或绵羊pVAX-MSTN.将猪Myostatin基因两位点突变同上方法连接至pVAX真核表达载体,命名为pVAX-MST...

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
前言
文献综述
    1 Myostatin基因的研究进展
        1.1 Myostatin基因的发现
        1.2 Myostatin基因的分子结构、组织特异性及同源性
        1.3 Myostatin蛋白的合成及生物学特性
        1.4 Myostatin的作用
        1.5 绵羊、猪Myostatin基因的研究进展
    2 基因疫苗的研究进展
        2.1 DNA疫苗的发现和发展历史
        2.2 基因免疫目的基因的来源
        2.3 基因疫苗表达载体的选择
        2.4 基因免疫中免疫佐剂的选择
        2.5 基因疫苗的接种途径
        2.6 基因免疫的优点
    3 Myostatin基因疫苗的研究进展
本试验的研究目的和意义
    一、Myostatin基因突变表达载体的构建
        1 材料和方法
            1.1 动物材料、菌株和质粒载体
                1.2 分子试验生化试剂
                1.3 主要仪器
                1.4 缓冲液与常用试剂的配制
                1.5 引物设计和序列分析软件
            2 基本试验方法
                2.1 猪、绵羊骨骼肌RNA提取、反转录
                    2.1.1 骨骼肌RNA的提取
                    2.1.2 RNA反转录产生cDNA
                2.2 PCR扩增猪、绵羊Myostatin基因序列
                    2.2.1 PCR扩增目的片段引物设计
                    2.2.2 Myostatin目的基因的扩增
                    2.2.3 PCR的反应过程
                2.3 琼脂糖凝胶电泳
                2.4 目的片段的琼脂糖凝胶回收
                2.5 目的片段连接至pEASY-T3载体、转化感受态细胞
                    2.5.1 猪、绵羊Myostatin基因连接至pEASY-T3载体
                    2.5.2 猪Myostatin基因连接至pEASY-T3载体的过程
                    2.5.3 绵羊Myostatin基因连接至pEASY-T3载体
                    2.5.4 转化感受态细胞
                2.6 质粒小量提取
                2.7 质粒进行单酶切鉴定
                2.8 Myostatin基因ATG前添加kozak序列
                2.9 猪、绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建
                    2.9.1 目的片段前添加kozak序列
                    2.9.2 目的片段与载体的双酶切
                    2.9.3 将加有kozak序列的Myostatin亚克隆至pVAX载体
                    2.9.4 猪Myostatin基因真核表达载体的构建过程
                    2.9.5 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建过程
                2.10 猪Myostatin基因突变表达载体的构建
                    2.10.1 Myostatin基因突变表达载体构建
                    2.10.2 猪Myostatin基因突变第一个表达载体的构建
                    2.10.3 猪Myostatin基因第二个突变表达载体的构建
        结果与分析
            1、猪、绵羊骨骼肌RNA提取
            2、猪、绵羊Myostatin基因cds区的PCR扩增
                2.1 猪、绵羊Myostatin基因cds区的PCR扩增电泳结果
                2.2 猪Myostatin基因PCR扩增测序结果
                2.3 绵羊Myostatin基因PCR扩增测序结果
            3、目的片段与pEASY-T3载体的连接及目的片段的亚克隆
            4、猪Myostatin基因突变表达载体构建
                4.1 pVAX-MSTN(T1)载体的构建
                    4.1.1 pVAX-MSTN(T1)载体的双酶切电泳结果
                    4.1.2 pVAX-MSTN (T1 )突变载体的部分测序结果
                4.2 pVAX-MSTN(T2)的构建
                    4.2.1 pVAX-MSTN(T2)载体的双酶切电泳结果
                    4.2.2 pVAX-MSTN (T2)突变载体的部分测序结果
        讨论
        小结
    二、猪Myostatin表达载体免疫小鼠
        材料与方法
            1 试验材料
                1.1 试验动物与试剂
                1.2 主要仪器
                1.3 主要试剂
            2 基本实验方法
                2.1 质粒大量提取
                2.2 小鼠免疫实验
                2.3 样品的采集与制备
                2.3.1 血清的收集
                2.3.2 肌肉的采集与固定
                2.4 ELISA检测抗体
                2.5 石蜡切片的制备
                2.6 肌肉组织显微结构观察
                2.7 数据的统计和处理
        结果与分析
            1、小鼠体重变化
            2、小鼠骨骼肌显微结构的观察
            3、ELISA检测小鼠血清Myostatin特异性抗体
                3.1 试验测得标准品和各个试验组OD值结果
                3.2 根据标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线
                3.3 ELISA检测小鼠血清Myostatin特异性抗体浓度
        讨论
全文结论
参考文献
Abstract
致谢



本文编号：3767266