昆虫细胞表达重组H5亚型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究
发布时间：2023-03-24 21:06
H5N1亚型高致病性禽流感不仅给养殖业带来了严重的危害,而且威胁人类健康与公共卫生安全。灭活疫苗免疫是目前防控禽流感的有效措施之一,但灭活苗候选株的筛选耗时费力,且疫苗生产过程涉及活病毒,存在生物安全隐患,并受鸡胚供应的限制。禽流感血凝素(Hemagglutinin, HA)亚单位疫苗可以避免灭活苗的缺点,HA蛋白是禽流感病毒主要表面抗原,具有刺激机体产生中和抗体的作用,是研发亚单位疫苗的主要靶标蛋白。其他研究表明杆状病毒表达系统表达的HA+M1蛋白,其生物学活性、抗原性和免疫原性方面与天然HA蛋白极为相似,但是目前关于杆状病毒表达系统表达HA蛋白,其生物学活性、抗原性和免疫原性方面报道相对较少。因此,本研究利用杆状病毒表达系统表达H5亚型禽流感HA蛋白,并对该重组蛋白的血凝活性、VLP (Virus-like particle, VLP)组装、免疫原性等进行研究。构建含HA基因的克隆载体。两种途径获得HA基因。用RT-PCR方法从禽流感(H5亚型,Re-6株)检测抗原中扩增HA基因,命名为L。另根据GenBank中HA基因进行比对分析,选取HA基因序列,命名为H。再根据昆虫细胞的密码...
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要英文缩写
文献综述
引言
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒等
1.2 主要试剂(盒)
1.3 溶液与培养基
1.3.1 抗生素母液
1.3.2 X-Gal、IPTG、PHA和MTT
1.3.3 LB培养基
1.3.4 PBS(PBST)缓冲液
1.3.5 琼脂糖凝胶电泳
1.3.6 Western blot相关溶液
1.4 PCR引物设计与合成
1.5 SDS-PAGE相关试剂
1.6 主要仪器
1.7 基因克隆及序列分析
1.7.1 RNA提取
1.7.2 反转录
1.7.3 目的基因扩增
1.7.4 连接与转化
1.7.5 重组克隆质粒鉴定
1.7.6 基因序列优化与合成
1.8 H5N1亚型禽流感HA基因重组
1.8.1 H-NSTHA基因片段克隆
1.8.2 H-HA基因片段克隆
1.8.3 L-NSTHA基因片段克隆
1.8.4 L-HA基因片段克隆
1.8.5 连接与转化
1.8.6 重组质粒鉴定
1.9 重组杆状病毒表达质粒的构建
1.9.1 双酶切
1.9.2 连接与转化
1.9.3 重组质粒鉴定
1.9.4 E.coli DH10Bac感受态细胞制备
1.9.5 重组质粒转化与筛选
1.9.6 重组真核表达质粒鉴定
1.10 重组杆状病毒的制备和鉴定
1.10.1 重组Bacmid DNA转染昆虫细胞
1.10.2 重组P2/P3代杆状病毒的扩增
1.10.3 重组杆状病毒鉴定
1.10.4 重组杆状病毒滴度测定
1.11 重组杆状病毒表达蛋白分析
1.11.1 重组蛋白SDS-PAGE分析
1.11.2 重组蛋白Western blot分析
1.11.3 间接免疫荧光(IFA)
1.11.4 重组蛋白的血凝价
1.11.5 电镜观察VLP形态
1.12 重组蛋白的免疫原性
1.12.1 动物免疫实验
1.12.2 CD4+、CD8+ T淋巴细胞动态变化检测
1.12.3 淋巴细胞转化实验
2 结果与分析
2.1 禽流感HA基因的克隆及序列分析
2.1.1 HA基因PCR扩增结果
2.1.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
2.1.3 HA基因测序结果与序列分析
2.2 H5亚型禽流感HA基因的重组
2.2.1 H-NSTHA基因的重组
2.2.2 L-NSTHA基因的重组
2.2.3 全基因的PCR片段的扩增
2.2.4 重组克隆质粒的酶切鉴定
2.3 重组真核表达载体的构建
2.3.1 重组供体质粒构建与鉴定
2.3.2 重组穿梭载体的构建与鉴定
2.4 重组杆状病毒的制备与鉴定
2.4.1 重组杆状病毒的制备
2.4.2 重组杆状病毒的鉴定
2.4.3 重组杆状病毒滴度的测定
2.5 重组蛋白在昆虫细胞上的表达
2.5.1 重组蛋白SDS-PAGE鉴定
2.5.2 重组蛋白Western blot分析
2.5.3 间接免疫荧光检测(IFA)
2.5.4 重组蛋白的血凝活性的检测
2.5.5 电镜观察结果
2.6 重组蛋白的免疫原性
2.6.1 HI检测抗体水平
2.6.2 间接ELISA检测抗体
2.6.3 CD4+、CD8+ T淋巴细胞动态变化
2.6.4 淋巴细胞增殖试验
3 讨论
3.1 高致病性禽流感H5N1 HA基因的设计
3.2 H5N1亚型禽流感重组HA蛋白在杆状病毒系统表达
3.3 重组HA蛋白免疫原性
结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3769850
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要英文缩写
文献综述
引言
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒等
1.2 主要试剂(盒)
1.3 溶液与培养基
1.3.1 抗生素母液
1.3.2 X-Gal、IPTG、PHA和MTT
1.3.3 LB培养基
1.3.4 PBS(PBST)缓冲液
1.3.5 琼脂糖凝胶电泳
1.3.6 Western blot相关溶液
1.4 PCR引物设计与合成
1.5 SDS-PAGE相关试剂
1.6 主要仪器
1.7 基因克隆及序列分析
1.7.1 RNA提取
1.7.2 反转录
1.7.3 目的基因扩增
1.7.4 连接与转化
1.7.5 重组克隆质粒鉴定
1.7.6 基因序列优化与合成
1.8 H5N1亚型禽流感HA基因重组
1.8.1 H-NSTHA基因片段克隆
1.8.2 H-HA基因片段克隆
1.8.3 L-NSTHA基因片段克隆
1.8.4 L-HA基因片段克隆
1.8.5 连接与转化
1.8.6 重组质粒鉴定
1.9 重组杆状病毒表达质粒的构建
1.9.1 双酶切
1.9.2 连接与转化
1.9.3 重组质粒鉴定
1.9.4 E.coli DH10Bac感受态细胞制备
1.9.5 重组质粒转化与筛选
1.9.6 重组真核表达质粒鉴定
1.10 重组杆状病毒的制备和鉴定
1.10.1 重组Bacmid DNA转染昆虫细胞
1.10.2 重组P2/P3代杆状病毒的扩增
1.10.3 重组杆状病毒鉴定
1.10.4 重组杆状病毒滴度测定
1.11 重组杆状病毒表达蛋白分析
1.11.1 重组蛋白SDS-PAGE分析
1.11.2 重组蛋白Western blot分析
1.11.3 间接免疫荧光(IFA)
1.11.4 重组蛋白的血凝价
1.11.5 电镜观察VLP形态
1.12 重组蛋白的免疫原性
1.12.1 动物免疫实验
1.12.2 CD4+、CD8+ T淋巴细胞动态变化检测
1.12.3 淋巴细胞转化实验
2 结果与分析
2.1 禽流感HA基因的克隆及序列分析
2.1.1 HA基因PCR扩增结果
2.1.2 重组克隆质粒的PCR鉴定
2.1.3 HA基因测序结果与序列分析
2.2 H5亚型禽流感HA基因的重组
2.2.1 H-NSTHA基因的重组
2.2.2 L-NSTHA基因的重组
2.2.3 全基因的PCR片段的扩增
2.2.4 重组克隆质粒的酶切鉴定
2.3 重组真核表达载体的构建
2.3.1 重组供体质粒构建与鉴定
2.3.2 重组穿梭载体的构建与鉴定
2.4 重组杆状病毒的制备与鉴定
2.4.1 重组杆状病毒的制备
2.4.2 重组杆状病毒的鉴定
2.4.3 重组杆状病毒滴度的测定
2.5 重组蛋白在昆虫细胞上的表达
2.5.1 重组蛋白SDS-PAGE鉴定
2.5.2 重组蛋白Western blot分析
2.5.3 间接免疫荧光检测(IFA)
2.5.4 重组蛋白的血凝活性的检测
2.5.5 电镜观察结果
2.6 重组蛋白的免疫原性
2.6.1 HI检测抗体水平
2.6.2 间接ELISA检测抗体
2.6.3 CD4+、CD8+ T淋巴细胞动态变化
2.6.4 淋巴细胞增殖试验
3 讨论
3.1 高致病性禽流感H5N1 HA基因的设计
3.2 H5N1亚型禽流感重组HA蛋白在杆状病毒系统表达
3.3 重组HA蛋白免疫原性
结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3769850
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3769850.html
