食淀粉乳杆菌对猪轮状病毒NSP4表达及相关效应的影响

发布时间：2023-03-25 02:03

　　轮状病毒(Rotavirus,RV)是婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病因,其所编码的非结构蛋白NSP4,功能之一是作为肠毒素引发腹泻,严重威胁着婴幼儿健康和养殖业。据报道,在RV感染过程中,整联蛋白α2β1作为RV的主要受体之一,涉及NSP4的表达及NSP4与细胞内钙离子、整联蛋白受体和相关酶的相互作用;已知益生菌及其培养上清能抑制RV感染,但是是否和如何通过NSP4发挥作用,有待近一步研究。据此,本研究运用食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus,L.A)及其培养上清,先后完成了食淀粉乳杆菌及其培养上清体内外抗RV能力分析;重组猪轮状病毒NSP4蛋白的表达、鉴定以及NSP4重组蛋白的免疫原性测定;体内外抗RV对细胞和空肠组织内NSP4、钙离子、磷脂酶C、Dicer和整联蛋白α2β1的检测,探讨其对NSP4表达的部分调节机制,阐释其在抗猪轮状病毒(Procine Rotavirus,PoRV)中的效应。为阐明益生菌与培养上清在抗RV作用的异同,该研究分为两部分,体外的细胞实验和体内的动物实验。体外实验中使用IPEC-J2细胞为平台,以A组猪轮状病毒OSU株为作用因子,...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 轮状病毒概况
        1.1.1 轮状病毒病原学特征
        1.1.2 NSP4在RV发病机制中的作用
        1.1.3 RV整联蛋白受体的研究
    1.2 益生菌概况
        1.2.1 益生菌的定义
        1.2.2 益生菌的功能效应和特性
        1.2.3 益生菌的安全性
        1.2.4 益生菌对肠道微生态系统的影响
    1.3 益生菌抗病毒概况
        1.3.1 益生菌抗病毒作用的研究现状
        1.3.2 益生菌抗病毒机制研究进展
        1.3.3 食淀粉乳杆菌及其抗病毒作用
        1.3.4 肠上皮细胞的应用
    1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌毒株、质粒、实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要溶剂配制
        2.1.4 主要实验仪器
    2.2 方法
        2.2.1 食淀粉乳杆菌培养上清抗RV能力的检测技术
        2.2.2 重组猪轮状病毒NSP4 蛋白的表达
        2.2.3 重组蛋白的纯化
        2.2.4 重组蛋白的Western-blot鉴定
        2.2.5 重组蛋白免疫原性测定
        2.2.6 食淀粉乳杆菌培养上清对IPEC-J2 细胞内NSP4 mRNA及相关因子的作用
        2.2.7 食淀粉乳杆菌对乳鼠空肠组织内NSP4 mRNA及相关因子的作用
        2.2.8 统计学方法
3 结果
    3.1 益生菌抗病毒功能测定
        3.1.1 IPEC-J2 细胞活力
        3.1.2 RV毒力测定
        3.1.3食淀粉乳杆菌培养上清的细胞毒性实验
        3.1.4 食淀粉乳杆菌培养上清对RV病毒的抑制率
    3.2 重组RV NSP4 蛋白的表达
        3.2.1 RV NSP4 基因的克隆
        3.2.2 重组菌的构建
        3.2.3 重组蛋白的表达
    3.3 重组蛋白的纯化和免疫原性鉴定
        3.3.1 重组蛋白的纯化
        3.3.2 Western-blot免疫原性鉴定
    3.4 免疫抗体检测
    3.5 食淀粉乳杆菌培养上清短长期预处理IPEC-J2 细胞抗RV中 NSP4 相关因素分析
        3.5.1 食淀粉乳杆菌培养上清短长期预处理IPEC-J2 细胞抗RV最强组
        3.5.2 间接免疫荧光鉴定
        3.5.3 实时荧光定量PCR检测食淀粉乳杆菌培养上清对NSP4 mRNA的影响
        3.5.4 IPEC-J2 细胞内钙离子测定
        3.5.5 IPEC-J2 细胞内磷脂酶C测定
        3.5.6 IPEC-J2 细胞整联蛋白α2β1 测定
        3.5.7 IPEC-J2 细胞内Dicer测定
    3.6 食淀粉乳杆菌抗RV中 NSP4 相关因素分析
        3.6.1 乳鼠体重变化及体重增长率
        3.6.2 轮状病毒ELISA检测
        3.6.3 食淀粉乳杆菌对乳鼠空肠组织NSP4 MRNA水平的影响
        3.6.4 食淀粉乳杆菌对乳鼠空肠组织中钙含量的影响
        3.6.5 乳鼠空肠组织中磷脂酶C的测定
        3.6.6 乳鼠空肠组织整联蛋白α2β1 的测定
        3.6.7 乳鼠空肠组织中Dicer的测定
4 讨论
    4.1 食淀粉乳杆菌培养上清体外抗RV作用
    4.2 食淀粉乳杆菌对RV感染乳鼠后的相关效应
    4.3 食淀粉乳杆菌及其培养上清在体内外对NSP4 功效的影响
    4.4 食淀粉乳杆菌及其培养上清在体内外对NSP4 表达及其相关因素的相互作用
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3770307