鸡巨噬细胞移动抑制因子原核表达与多克隆抗体的制备
发布时间：2023-03-27 01:52
巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是动物界发现较早且最为保守的细胞因子之一,具有调节免疫机能,参与炎症反应,参与物质代谢调节等功能。MIF具有“多效(pleiotropic)性”,能通过多种机制介导先天性和获得性免疫,诱导细胞因子、趋化因子(chemokines)和粘附因子的分泌及聚集,或者与糖皮质激素和下丘脑-垂体-肾上腺皮轴相互作用,影响细胞增殖、凋亡和吞噬作用,激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)系统,从而在脓毒血症、感染和炎症性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥、动脉硬化、癌症等多种疾病中扮演重要角色。对于MIF的研究主要集中在人及实验动物上,关于家禽家畜MIF的研究涉及较少。本课题旨在获得鸡重组MIF,并制备抗鸡MIF抗体。 首先将构建并鉴定的原核表达载体pEASY-E1-MIF转入表达感受态BL21(DE3),得到转化子；其次对IPTG诱导表达进行优化；再利用Ni-NTA柱进行纯化；最后,用纯化的鸡MIF蛋白免疫家兔,获得抗鸡MIF血清,利用免疫印迹法对自...
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
前言
文献综述
1 MIF的简介
2 MIF的来源、结构及多态性
2.1 MIF的来源
2.2 MIF的结构及多态性
3 MIF的生物学功能
3.1 MIF对糖皮质激素作用
3.2 MIF是免疫和炎症性疾病的重要前炎症细胞因子
3.3 在T淋巴细胞介导的免疫性疾病中的作用
3.4 在巨噬细胞介导的先天免疫反应中的作用
3.5 在基质金属蛋白酶(MMPs)介导的组织损伤中的作用
3.6 调节物质能量代谢
4 MIF的分子作用机制
5 MIF与各种疾病
5.1 MIF与心血管系统疾病
5.2 MIF与皮肤病
5.3 MIF与肿瘤
6 结语
本实验立项依据和研究意义
本实验的基本思路
一、鸡MIF蛋白原核表达
1 实验材料
1.1 实验材料与主要试剂
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 缓冲液与常用试剂的配制
2 试验方法
2.1 质粒的鉴定
2.1.1 质粒的提取
2.1.2 重组质粒的酶切鉴定
2.1.3 测序鉴定
2.2 重组MIF蛋白的表达
2.2.1 重组MIF蛋白的小量表达
2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况
2.2.3 MIF蛋白表达形式分析
3 实验结果
3.1 阳性质粒酶切与测序鉴定结果
3.2 重组MIF蛋白小量表达结果
3.3 MIF蛋白表达形式
4 讨论
二、鸡MIF的纯化和初步鉴定
1 实验材料
1.1 实验材料与主要试剂
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 缓冲液的配制
2 实验方法
2.1 MIF蛋白大量表达及纯化
2.2 定量测定纯化MIF蛋白
2.3 表达产物Western blot鉴定
3 实验结果
3.1 MIF蛋白大量表达纯化结果
3.2 纯化MIF蛋白的蛋白定量分析
3.3 表达产物Western blot鉴定
4 讨论
三、鸡MIF多克隆抗体的制备
1 实验材料
1.1 试验动物与试剂
1.2 主要仪器
1.3 缓冲液的配制
2 实验方法
2.1 原核表达MIF蛋白
2.2 家兔免疫
2.3 样品的采集与检测
2.3.1 血清的收集
2.3.2 抗体效价的检测
2.3.3 Westem Blot检测
3 结果与分析
3.1 ELISA实验
3.2 Western blot鉴定
4 讨论
四、全文总结
参考文献
ABSTRACT
致谢
本文编号：3772141
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
前言
文献综述
1 MIF的简介
2 MIF的来源、结构及多态性
2.1 MIF的来源
2.2 MIF的结构及多态性
3 MIF的生物学功能
3.1 MIF对糖皮质激素作用
3.2 MIF是免疫和炎症性疾病的重要前炎症细胞因子
3.3 在T淋巴细胞介导的免疫性疾病中的作用
3.4 在巨噬细胞介导的先天免疫反应中的作用
3.5 在基质金属蛋白酶(MMPs)介导的组织损伤中的作用
3.6 调节物质能量代谢
4 MIF的分子作用机制
5 MIF与各种疾病
5.1 MIF与心血管系统疾病
5.2 MIF与皮肤病
5.3 MIF与肿瘤
6 结语
本实验立项依据和研究意义
本实验的基本思路
一、鸡MIF蛋白原核表达
1 实验材料
1.1 实验材料与主要试剂
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 缓冲液与常用试剂的配制
2 试验方法
2.1 质粒的鉴定
2.1.1 质粒的提取
2.1.2 重组质粒的酶切鉴定
2.1.3 测序鉴定
2.2 重组MIF蛋白的表达
2.2.1 重组MIF蛋白的小量表达
2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况
2.2.3 MIF蛋白表达形式分析
3 实验结果
3.1 阳性质粒酶切与测序鉴定结果
3.2 重组MIF蛋白小量表达结果
3.3 MIF蛋白表达形式
4 讨论
二、鸡MIF的纯化和初步鉴定
1 实验材料
1.1 实验材料与主要试剂
1.1.1 菌株和质粒
1.1.2 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 缓冲液的配制
2 实验方法
2.1 MIF蛋白大量表达及纯化
2.2 定量测定纯化MIF蛋白
2.3 表达产物Western blot鉴定
3 实验结果
3.1 MIF蛋白大量表达纯化结果
3.2 纯化MIF蛋白的蛋白定量分析
3.3 表达产物Western blot鉴定
4 讨论
三、鸡MIF多克隆抗体的制备
1 实验材料
1.1 试验动物与试剂
1.2 主要仪器
1.3 缓冲液的配制
2 实验方法
2.1 原核表达MIF蛋白
2.2 家兔免疫
2.3 样品的采集与检测
2.3.1 血清的收集
2.3.2 抗体效价的检测
2.3.3 Westem Blot检测
3 结果与分析
3.1 ELISA实验
3.2 Western blot鉴定
4 讨论
四、全文总结
参考文献
ABSTRACT
致谢
本文编号：3772141
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