鸡白痢沙门菌减毒DIVA疫苗候选株的无痕构建及其安全性与免疫保护效力研究

发布时间：2023-03-31 22:16

　　鸡白痢沙门菌是严重危害我国家禽养殖业健康发展的常见病原菌之一,雏鸡被感染后发病率和死亡率极高。该菌既可以水平传播,也可以垂直传播,难以在种禽养殖场被清除净化。简单高效低成本地防控鸡群中鸡白痢沙门菌成为当前亟待解决的难题。疫苗接种被认为是降低鸡群感染和防控鸡白痢沙门菌的有效措施之一。沙门菌spiC基因是重要的毒力基因,该基因缺失可显著致弱沙门菌的毒力,并恰当地平衡疫苗候选株的毒力和免疫原性。脂多糖不仅是细菌外膜的组成部分,也是沙门菌毒力的重要因素之一,常被选为DIVA疫苗的靶标分子。沙门菌减毒疫苗候选株主要运用现代基因工程的同源重组方法敲除一个或多个基因所得,具有遗传背景清晰,操作容易,制备快捷等优点;但常用的同源重组方法,由于筛选的需要,基因缺失株往往残留抗生素基因或部分外源片段,给缺失基因的恢复或其它外源基因的插入提供可能性,遗传稳定性存在安全隐患。因此,为了满足转基因微生物安全评估的要求,通过无痕基因敲除技术构建基因缺失疫苗候选株,不残留有任何外源基因或碱基,就显得十分必要。本研究利用无痕敲除的同源重组方法,同时缺失spiC和rfaL或rfaH基因,构建鸡白痢沙门菌S06004△s...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
符号说明
综述 禽沙门菌病的危害与防控研究进展
    1 禽沙门菌病的流行与危害
    2 致病机制
    3 禽沙门菌病防控措施
        3.1 噬菌体
        3.2 益生菌
        3.3 抗生素
        3.4 疫苗
            3.4.1 灭活疫苗
            3.4.2 亚单位疫苗
            3.4.3 减毒活疫苗
            3.4.4 基因工程构建新型疫苗
                3.4.4.1 构建有痕的基因工程疫苗
                3.4.4.2 减毒活疫苗的无痕构建
            3.4.5 动物用转基因微生物安全评估要求
    4 结语
第一章 鸡白痢沙门菌疫苗候选株的无痕构建与生物学特性研究
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌株与质粒
            1.1.2 实验动物
            1.1.3 主要试剂
            1.1.4 主要仪器设备
        1.2 方法
            1.2.1 引物设计与合成
            1.2.2 靶片段的扩增
            1.2.3 线性自杀载体的制备
            1.2.4 感受态细菌的制备
            1.2.5 电击转化
            1.2.6 供体菌E.coli.χ7213与受体菌S06004△spiC接合转移及筛选阳性菌
            1.2.7 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL的生化特性鉴定
            1.2.8 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL的生长特性鉴定
            1.2.9 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL的LD₅₀毒力测定
            1.2.10 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL对HD-11细胞的黏附、侵袭以及增殖实验
            1.2.11 数据统计与分析
    2 结果
        2.1 S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的构建与鉴定
        2.2 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的生化特性鉴定
        2.3 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的生长特性鉴定
        2.4 双基因缺失株S06004△piC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的LD₅₀毒力测定
        2.5 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL对HD-11细胞的黏附与侵袭
        2.6 双基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL在HD-11细胞内增殖
    3 讨论
第二章 鸡白痢沙门菌疫苗候选株安全性与免疫保护效力评价
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌株
            1.1.2 实验动物
            1.1.3 主要试剂
            1.1.4 主要仪器设备
        1.2 方法
            1.2.1 引物设计与合成
            1.2.2 疫苗候选株的制备与免疫
            1.2.3 雏鸡接种后体重变化
            1.2.4 疫苗候选株在雏鸡体内动态消减情况
            1.2.5 疫苗候选株免疫雏鸡后组织病理学观察
            1.2.6 间接ELISA测定血清IgG抗体效价
            1.2.7 细胞因子检测
            1.2.8 疫苗候选株肌注途径对雏鸡的免疫保护效力
            1.2.9 疫苗候选株口服途径的免疫保护效力
            1.2.10 疫苗候选株的DIVA功能
            1.2.11 数据统计与分析
    2 结果
        2.1 雏鸡接种后体重变化
        2.2 疫苗候选株在雏鸡体内定殖情况
        2.3 疫苗候选株免疫雏鸡后组织病理学观察
        2.4 间接ELISA测定血清IgG抗体效价
        2.5 细胞因子检测
        2.6 疫苗候选株肌注途径对雏鸡的免疫保护效力
        2.7 疫苗候选株口服途径的免疫保护效力
        2.8 疫苗候选株的DIVA功能
    3 讨论
参考文献
致谢



本文编号：3775889