FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究

发布时间：2023-04-01 10:26

　　FHL2(four and a half LIM domains protein 2)属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显著,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR(RT-PCR)方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测F...

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用
        1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点
        1.1.2 卵泡发育的调控
        1.1.3 颗粒细胞的功能
        1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响
        1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响
    1.2 FHL2基因的研究进展
        1.2.1 FHL2基因的结构
        1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位
        1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能
        1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究
    1.3 蛋白质互作研究进展
        1.3.1 酵母双杂交技术
        1.3.2 酵母双杂交技术的特点
        1.3.3 酵母双杂交技术的应用
    1.4 本研究的目的和意义
2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位
    2.1 材料
        2.1.1 样品来源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 实验主要溶液配制
        2.1.5 主要生物信息学分析软件
    2.2 方法
        2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析
        2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析
        2.2.3 免疫组化分析
        2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定
        2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析
        2.2.6 细胞定位
        2.2.7 数据统计
    2.3 结果
        2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析
        2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析
        2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位
        2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征
        2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位
        2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达
    2.4 讨论
        2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞
        2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究
    2.5 小结
3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究
    3.1 材料
        3.1.1 样品来源
        3.1.2 主要试剂与耗材
        3.1.3 试验主要仪器设备
        3.1.4 主要溶液的配置
    3.2 方法
        3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定
        3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞
        3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测
        3.2.4 数据统计
    3.3 结果
        3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定
        3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响
        3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果
        3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究
    4.1 材料
        4.1.1 样品来源
        4.1.2 主要试剂与耗材
        4.1.3 试验主要仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响
        4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响
        4.2.3 数据统计
    4.3 结果
        4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响
        4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响
        4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响
        4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响
        4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响
    4.4 讨论
        4.4.1 FHL2对细胞周期的影响
        4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响
        4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响
    4.5 小结
5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选
    5.1 材料
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要溶液配制
    5.2 方法
        5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定
        5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定
        5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白
        5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证
    5.3 结果
        5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建
        5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建
        5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验
        5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白
        5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析
        5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证
    5.4 讨论
        5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建
        5.4.2 酵母诱饵质粒的构建
        5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究
    5.5 小结
6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用
    6.1 材料
        6.1.1 样品来源
        6.1.2 试验主要溶液配制
    6.2 方法
        6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达
        6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1
        6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响
        6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞
        6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究
        6.2.6 数据统计
    6.3 结果
        6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定
        6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达
        6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达
        6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响
        6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响
        6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究
    6.4 讨论
        6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达
        6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究
    6.5 小结
7 结论
8 本研究创新点
参考文献
在读期间发表的学术论文
作者简介
致谢
附件



本文编号：3776973