H5N6亚型禽流感病毒NS1蛋白的鸭宿主互作蛋白鉴定

发布时间：2023-04-01 13:37

　　A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起人和多种动物的高度接触性急性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)划分为通报疫病。非结构蛋白NS1蛋白(nonstructural protein 1,NS1)通过与细胞内的多种宿主蛋白发生相互作用来调节流感病毒的感染过程,是调节AIV致病性的关键因子。为鉴定与H5N6亚型禽流感病毒NS1蛋白有相互作用的宿主蛋白,本研究:1.Strep标签H5N6重组AIV的构建。用RT-PCR扩增HN109病毒的8个基因片段,分别连接到pBD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77-84位的氨基酸替换成Strep标签。将8个重组质粒共转染293T细胞,拯救出重组病毒株rHN109-NS1-Strep。经测序验证,拯救病毒的8个基因片段与设计基因一致。测序比对与蛋白表达验证Strep标签可以稳定遗传于F5代以内的重组病毒;重组毒株与野生毒株在MDCK细胞上复制水平相似,在小鼠体内复制能力也相似。2.鸭肺原代上皮细胞的分离培养与鉴定。用组织贴块法从24 d SPF鸭胚中分离肺原代细胞,经差速消化法纯化传代,纯化三代后,靶标上皮...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Summary
缩略语表
第一篇 文献综述
    1 流感病毒
    2 禽流感病毒及其结构
        2.1 血凝素HA蛋白
        2.2 神经氨酸酶NA蛋白
        2.3 病毒聚合酶蛋白PB2、PB1、PA
        2.4 核衣壳蛋白NP
        2.5 基质蛋白M
        2.6 非结构蛋白NS
    3 流感病毒的抗病毒机制及非结构蛋白NS1的作用
        3.1 细胞抗病毒机制的拮抗作用
        3.2 NS1拮抗RNA干扰（RNAi）途径
        3.3 NS1参与细胞凋亡
        3.4 NS1蛋白调控树突状细胞的成熟
    4 流感病毒的复制
        4.1 受体结合并细胞进入
        4.2 膜融合和脱壳
        4.3 RNA复制和翻译
        4.4 病毒装配和释放
    5. 研究目的与意义
第二篇 试验部分
    第一章 表达Strep标签的重组H5N6亚型禽流感病毒的构建
        1 材料与方法
            1.1 细胞、毒株和实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
            1.4 RNA的提取与病毒RNA的反转录
            1.5 引物设计与合成
            1.6 病毒各基因片段的PCR扩增与回收
            1.7 连接、转化和阳性菌的筛选
            1.8 携带Strep标签的NS1重组质粒的构建
            1.9 八个重组阳性质粒中提
            1.10 293T细胞的传代与培养
            1.11 病毒拯救与纯化
            1.12 获救病毒的序列鉴定
            1.13 拯救病毒F5代以内Strep标签遗传稳定性鉴定
            1.14 病毒感染MDCK细胞的生长曲线
            1.15 病毒感染小鼠致病性试验
            1.16 病毒滴定
        2 结果
            2.1 HN109各基因片段的扩增及重组质粒的构建
            2.2 病毒拯救与鉴定
            2.3 拯救病毒F5代以内Strep标签的遗传稳定性鉴定
            2.4 病毒感染MDCK细胞的生长曲线
            2.5 病毒感染小鼠致病性试验
        3 讨论
    第二章 鸭肺原代上皮细胞的分离与鉴定
        1 材料与方法
            1.1 SPF鸭胚与鸭肺脏组织来源
            1.2 试剂
            1.3 主要仪器
            1.4 鸭肺原代上皮细胞的分离
            1.5 鸭肺原代上皮细胞的原代培养
            1.6 鸭肺原代上皮细胞的纯化传代培养
            1.7 免疫荧光鉴定鸭肺原代上皮细胞
            1.8 鸭肺原代上皮细胞生长曲线的测定
        2 结果
            2.1 鸭肺原代上皮细胞的分离与原代培养
            2.2 鸭肺原代上皮细胞的纯化传代培养
            2.3 免疫荧光鉴定鸭肺原代上皮细胞
            2.4 鸭肺原代上皮细胞生长曲线的测定
        3 讨论
    第三章 与NS1-strep互作的鸭宿主蛋白鉴定
        1 材料和方法
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 主要试剂的配制
            1.4 与NS1-Strep互作的宿主蛋白复合物的纯化
            1.5 SDS-PAGE银染分析与NS1-strep互作的鸭宿主蛋白
            1.6 Western blotting分析与NS1-strep互作的鸭宿主蛋白
            1.7 质谱分析与 NS1-strep 互作的鸭宿主蛋白
        2 结果
            2.1 SDS-PAGE银染分析与NS1-strep互作的鸭宿主蛋白
            2.2 Western blot分析与NS1-strep互作的鸭宿主蛋白
            2.3 质谱鉴定纯化后的蛋白质复合物
        3 讨论
全文总结
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3777238