脱二氧喹赛多、脱二氧乙酰甲喹抗体制备及酶联免疫吸附检测方法的建立

发布时间：2023-04-01 21:52

　　喹赛多和乙酰甲喹是人工合成的兽药,属于喹噁啉类药物,具有良好的抗菌及促生长作用,被广泛用于畜禽养殖业中。研究表明,喹赛多与同类药物相比毒性小、安全性较好,但其一些代谢产物多对动物存在潜在毒性,会引起食品安全问题。乙酰甲喹的毒性相对较大,长期使用或滥用会危害动物和人类的健康。因此,建立一种快速、灵敏的检测方法检测动物可食性组织中喹赛多和乙酰甲喹的残留情况有重大意义。本研究分别以脱二氧喹赛多和脱二氧乙酰甲喹为研究对象,旨在建立一种快速、灵敏、高通量的基于抗体的免疫学残留检测方法---酶联免疫吸附法(ELISA)。 脱二氧喹赛多(Cy4)是喹赛多的一种主要代谢产物,已被确定为其残留标志物。本论文根据脱二氧喹赛多的结构特征,通过羧甲基羟胺的肟化作用引入羧基,再采用混合酸酐法与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,合成了免疫抗原Cy4-BSA和检测抗原Cy4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后获得了效价高、灵敏度较高的多克隆抗体,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤进行细胞融合,经三次细胞克隆和筛选,获得了3株能稳定分泌Cy4单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3C5、D9D2、F10D2)。制备了单克隆抗体腹水...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
    1.1 喹噁啉类药物的概况
    1.2 喹赛多的研究进展
        1.2.1 喹赛多及其理化性质
        1.2.2 喹赛多的代谢研究
        1.2.3 喹赛多的安全性研究
        1.2.4 脱二氧喹赛多及其理化性质
    1.3 喹赛多及其代谢产物检测方法研究进展
        1.3.1 仪器检测方法
            1.3.1.1 高效液相色谱法
            1.3.1.2 液相色谱串联质谱法
            1.3.1.3 液相色谱串联离子捕获时间飞行质谱法
            1.3.1.4 超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法
            1.3.1.5 超高效液相色谱串联电喷雾质谱法
        1.3.2 酶联免疫检测方法
    1.4 乙酰甲喹的研究进展
        1.4.1 乙酰甲喹及其理化性质
        1.4.2 乙酰甲喹的代谢研究
        1.4.3 乙酰甲喹的安全性研究
        1.4.4 脱二氧乙酰甲喹及其理化性质
    1.5 乙酰甲喹及其代谢产物检测方法研究进展
        1.5.1 仪器检测方法
            1.5.1.1 高效液相色谱法
            1.5.1.2 液相色谱串联质谱法
            1.5.1.3 超高效液相色谱串联质谱法
            1.5.1.4 超声波辅助分散液-液微萃取联合高效液相色谱紫外检测法
        1.5.2 酶联免疫吸附检测方法
    1.6 免疫分析在兽药残留检测中的应用
        1.6.1 酶联免疫吸附法
        1.6.2 化学发光免疫法
        1.6.3 电化学免疫法
        1.6.4 量子点荧光免疫法
        1.6.5 微阵列法
        1.6.6 免疫层析试纸条法
    1.7 选题目的和意义
第二章 脱二氧喹赛多单克隆抗体制备
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要试剂材料
        2.2.2 主要仪器设备
        2.2.3 主要溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 脱二氧喹赛多完全抗原的制备
            2.3.1.1 脱二氧喹赛多的肟化
            2.3.1.2 免疫抗原的制备
            2.3.1.3 检测抗原的制备
        2.3.2 脱二氧喹赛多完全抗原的鉴定
            2.3.2.1 质谱法鉴定免疫抗原
            2.3.2.2 紫外扫描法鉴定检测抗原
        2.3.3 小鼠免疫和多克隆抗体的制备
        2.3.4 脱二氧喹赛多多克隆抗体的检测
            2.3.4.1 方阵法确定最佳检测抗原浓度
            2.3.4.2 间接ELISA测定多克隆抗体的效价
            2.3.4.3 多克隆抗体间接竞争ELISA检测
            2.3.4.4 多克隆抗体特异性分析
        2.3.5 脱二氧喹赛多单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
            2.3.5.1 Sp2/0瘤细胞的复苏与传代培养
            2.3.5.2 饲养细胞的制备
            2.3.5.3 骨髓瘤细胞的制备
            2.3.5.4 免疫脾细胞的制备
            2.3.5.5 细胞融合及培养
            2.3.5.6 阳性孔的筛选
            2.3.5.7 阳性孔的克隆
            2.3.5.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏
        2.3.6 脱二氧喹赛多单克隆抗体腹水的制备
        2.3.7 脱二氧喹赛多单克隆抗体的纯化
        2.3.8 脱二氧喹赛多单克隆抗体特性的鉴定
            2.3.8.1 单克隆抗体蛋白浓度的测定
            2.3.8.2 细胞培养上清和单克隆抗体效价的测定
            2.3.8.3 单克隆抗体的亚型鉴定
            2.3.8.4 单克隆抗体亲和力常数的测定
            2.3.8.5 单克隆抗体的ic-ELISA检测
            2.3.8.6 单克隆抗体特异性鉴定
    2.4 结果与分析
        2.4.1 免疫抗原MALDI-TOF-MS鉴定结果
        2.4.2 检测抗原紫外扫描鉴定结果
        2.4.3 脱二氧喹赛多多克隆抗体的检测结果
            2.4.3.1 最佳检测抗原浓度的确定
            2.4.3.2 多克隆抗体效价的测定
            2.4.3.3 多克隆抗体间接竞争ELISA检测结果
            2.4.3.4 多克隆抗体特异性结果
        2.4.4 杂交瘤细胞株的建立
        2.4.5 脱二氧喹赛多单克隆抗体的特性鉴定
            2.4.5.1 单克隆抗体的浓度测定结果
            2.4.5.2 细胞培养上清和单克隆抗体效价测定结果
            2.4.5.3 单克隆抗体的亚型鉴定结果
            2.4.5.4 单克隆抗体亲和常数测定结果
            2.4.5.5 单克隆抗体间接竞争ELISA检测结果
            2.4.5.6 单克隆抗体特异性鉴定结果
    2.5 讨论
第三章 脱二氧喹赛多单克隆抗体酶联免疫吸附检测法的建立
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 主要试剂材料
        3.2.2 主要仪器设备
        3.2.3 主要溶液配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 间接竞争ELISA条件优化
            3.3.1.1 检测抗原浓度优化
            3.3.1.2 封阻液浓度的优化
            3.3.1.3 二甲亚砜浓度优化
            3.3.1.4 单克隆抗体稀释度优化
            3.3.1.5 标品与单克隆抗体比例优化
            3.3.1.6 竞争反应时间优化
            3.3.1.7 二抗稀释度优化
        3.3.2 间接竞争ELISA标准曲线的建立
        3.3.3 样品加标处理
        3.3.4 加标回收率检测
    3.4 结果与分析
        3.4.1 间接竞争ELISA工作条件的优化
            3.4.1.1 检测抗原浓度优化结果
            3.4.1.2 封阻液浓度优化结果
            3.4.1.3 二甲亚砜浓度优化结果
            3.4.1.4 单克隆抗体稀释度优化结果
            3.4.1.5 标品与单克隆抗体比例优化结果
            3.4.1.6 竞争反应时间优化结果
            3.4.1.7 二抗稀释度优化结果
        3.4.2 间接竞争ELISA标准曲线的建立
        3.4.3 加标回收检测结果
    3.5 讨论
第四章 脱二氧乙酰甲喹多克隆抗体的制备
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 主要试剂材料
        4.2.2 主要仪器设备
        4.2.3 主要溶液配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 脱二氧乙酰甲喹完全抗原的制备
            4.3.1.1 脱二氧乙酰甲喹的肟化
            4.3.1.2 脱二氧乙酰甲喹与BSA、OVA的偶联
        4.3.2 脱二氧乙酰甲喹完全抗原的鉴定
            4.3.2.1 质谱法鉴定免疫抗原
            4.3.2.2 紫外扫描法鉴定检测抗原
        4.3.3 小鼠免疫和多克隆抗体的制备
        4.3.4 脱二氧乙酰甲喹多克隆抗体的检测
            4.3.4.1 方阵法确定最佳检测抗原浓度
            4.3.4.2 多克隆抗体效价检测
            4.3.4.3 多克隆抗体间接竞争ELISA检测
            4.3.4.4 多克隆抗体特异性分析
        4.3.5 脱二氧乙酰甲喹多克隆抗体加标回收检测
    4.4 结果与分析
        4.4.1 免疫抗原MALDI-TOF-MS鉴定结果
        4.4.2 检测抗原紫外扫描鉴定结果
        4.4.3 脱二氧乙酰甲喹多克隆抗体的检测结果
            4.4.3.1 最佳检测抗原浓度的确定
            4.4.3.2 多克隆抗体效价的测定
            4.4.3.3 多克隆抗体间接竞争ELISA检测结果
            4.4.3.4 多克隆抗体特异性结果
        4.4.4 脱二氧乙酰甲喹多克隆抗体加标回收检测结果
    4.5 讨论
第五章 总结与展望
    5.1 总结
    5.2 创新点
    5.3 展望
硕士研究生期间论文发表情况
参考文献
致谢



本文编号：3777927