猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立及应用研究

发布时间：2023-04-02 01:53

　　猪附红细胞体病是由附红细胞体寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓,引起不明原因的发热、黄疸、贫血等症状的一种人兽共患传染病。由于动物感染附红细胞体带来的危害日益严重,受到了各国的普遍关注,尤其在近几年给我国的畜牧养殖业造成重大损失。目前,该病没有标准的免疫控制方法和特效治疗药物,所因此,建立一种适合于临床快速诊断出该病的检测方法,减少该病对人畜的健康危害,对该病的控制及预防都具有重要意义。本研究依据GenBank发布的猪附红细胞体Eno基因序列,设计合成一对特异性引物,在引物的上下游5’端分别标记上生物素(BIOT)和地高辛(DIG),扩增获得PCR产物。按照PCR-ELISA方法操作,通过优化包被液种类、包被液浓度、结合抗体的反应条件、封闭条件、PCR产物稀释度及显色时间等,确定最优条件。通过检测的30份阴性样本的OD值计算本研究建立的PCR-ELISA方法的临界值。通过检测猪附红细胞体基因组DNA梯度稀释的OD值,测定该方法敏感性。通过扩增猪附红细胞体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫及健康猪血基因DNA片段,检测所建立PCE-ELISA方法的特异性。通过对同一批次、不同批次包...

【文章页数】：40 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
    1 附红细胞体病的概述
        1.1 病原学
        1.2 流行病学
        1.3 危害
    2 诊断方法的研究进展
        2.1 直接镜检法
        2.2 血清学诊断法
        2.3 分子生物学诊断方法
    3 PCR-ELISA技术研究进展
        3.1 引物探针标记法
        3.2 双引物标记法
        3.3 PCR-ELISA技术的应用
    4 本研究的目的及意义
材料与方法
    1 材料
        1.1 试验样本
        1.2 其他病原体
        1.3 引物
        1.4 试验用试剂
        1.5 主要试剂以及配制方法
    2 方法
        2.1 血液DNA模板的提取
        2.2 PCR扩增与最佳退火温度筛选
        2.3 PCR-ELISA检测方法操作步骤
        2.4 包被液的比较与选择
        2.5 链酶亲和素浓度及抗地高辛抗体稀释浓度的选择
        2.6 封闭条件筛选
        2.7 显色时间筛选
        2.8 PCR循环数以及稀释倍数的筛选
        2.9 PCR-ELISA临界值的确定
        2.10 PCR-ELISA特异性检测
        2.11 PCR-ELISA敏感性检测
        2.12 PCR-ELISA重复性检测
        2.13 临床样本检测
结果
    3.1 目的基因PCR扩增及退火温度筛选
    3.2 包被液的比较与选择
    3.3 链酶亲和素浓度及抗地高辛抗体稀释浓度的选择
    3.4 封闭条件筛选
    3.5 显色时间筛选
    3.6 PCR循环数以及稀释倍数的筛选
    3.7 PCR-ELISA临界值的确定
    3.8 PCR-ELISA特异性试验
    3.9 PCR-ELISA敏感性检测
    3.10 PCR-ELISA重复性检测
    3.11 临床样本检测
讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
附录



本文编号：3778291