传染性法氏囊病病毒抑制宿主细胞干扰素-β表达的机制研究
发布时间：2023-04-03 23:46
传染性法氏囊病病毒(IBDV)属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属,主要侵害3-6周龄的雏鸡,发病后导致严重的免疫抑制,目前对该病引起的免疫抑制机理依然不甚明了。本研究利用IBDV体外感染模型,系统研究了IBDV基因组dsRNA及其编码的病毒蛋白与宿主干扰素系统间的相互影响,旨在为深入研究IBDV的免疫抑制机制和寻找潜在药物治疗靶点奠定基础。Ⅰ型干扰素是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,模式识别受体RLR和TLR是抗病毒先天免疫反应过程中介导Ⅰ型干扰素表达的主要途径。鸡Ⅰ型干扰素是最先被发现和命名的,但对于鸡抗病毒先天免疫过程中干扰素的诱生过程依然不是很清楚。本研究首先克隆了鸡MAVS基因,通过与哺乳动物MAVS比较,发现鸡MAVS具有与哺乳动物MAVS相同的结构域组成及亚细胞定位关系。功能分析发现,鸡MAVS与胞内dsRNA诱导鸡IFN-p的表达密切相关。通过构建鸡MAVS和转录因子IRF3共表达载体转染细胞后发现,在过表达鸡MAVS上调鸡IFN-β表达的过程中,IRF3并不发生入核,表明鸡MAVS与胞内dsRNA诱导鸡IFN-p的表达相关,但在此过程中不涉及转录因子IRF3的入核。体内研...
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
论文创新点
摘要
ABSTRACT
研究意义
技术路线
第一部分 文献综述
第一章 病毒感染与宿主抗病毒免疫研究进展
1 先天免疫在抗病毒反应过程中的作用
1.1 干扰素抗病毒作用的机制
1.2 病毒感染诱导宿主产生IFN-α/β的过程
1.2.1 RLR通路
1.2.2 TLR通路
1.3 宿主对RLR通路介导IFN-β表达的调控机制
1.3.1 泛素化修饰对于RLR抗病毒信号的调控
1.3.2 去泛素化酶对RLR抗病毒信号的调控
1.3.3 磷酸化修饰对于RLR抗病毒信号的调控
1.3.4 Ⅰ型干扰素的正反馈调节作用
2 病毒逃逸先天免疫抗病毒反应的策略
2.1 病毒抑制诱导IFN产生的信号
2.2 病毒广泛抑制宿主蛋白的表达
2.3 病毒抑制IFN下游信号的转导
2.4 病毒抑制IFN诱导产生的抗病毒蛋白活性
2.5 病毒蛋白劫持宿主泛素系统的功能
3 禽类抗病毒免疫相关模式识别受体
3.1 禽类TLR3、7、15、21
3.2 禽类RLRs
第二章 IBDV致病机制的研究进展
1 IBDV简介
1.1 IBDV的基因组特点
1.2 IBDV编码的蛋白
1.2.1 VP1蛋白
1.2.2 VP2蛋白
1.2.3 VP3蛋白
1.2.4 VP4蛋白
1.2.5 VP5蛋白
2 IBDV侵入宿主细胞的机制
2.1 病毒侵入宿主的方式
2.2 IBDV的细胞受体
2.2.1 鸡B淋巴细胞受体
2.2.2 成纤维细胞受体
2.2.3 其他细胞受体
3 IBD导致免疫抑制的机制
第二部分 研究内容
第一章 鸡MAVS的克隆及功能分析
摘要
1 材料
1.1 主要仪器与器材
1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物
2 方法
2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
2.2 总RNA的抽提和反转录反应
2.3 感受态细胞的制备
2.4 转化
2.5 DNA片段的回收
2.6 T-A克隆和序列测定
2.7 半定量RT-PCR及光密度分析
2.8 生物信息学软件对鸡MAVS结构域的预测
2.9 鸡MAVS真核表达载体及结构域缺失突变体的构建
2.10 共表达载体的构建
2.11 SDS-PAGE及Western blot分析
2.12 质粒抽提
2.13 RNA干扰
2.14 转染与激光共聚焦观察
2.15 间接免疫荧光(IFA)
2.16 荧光素酶报告基因实验
2.17 胞内Poly(I：C)刺激和荧光定量PCR(qRT-PCR)实验
2.18 病毒滴度的测定
2.19 统计学分析
3 结果
3.1 鸡MAVS的克隆、序列测定和生物信息学分析
3.2 鸡MAVS与其他物种MAVS的同源性及进化分析
3.3 chMAVS的亚细胞定位
3.4 chMAVS在chIFN-β诱生过程中的作用
3.5 chMAVS各结构域对chIFN-β表达的影响
3.6 chMAVS介导chIFN-β的诱生不需要IRF3的入核
3.7 chMAVS具有抗IBDV的功能
4 讨论
第二章 IBDV感染对宿主细胞·型干扰素系统的影响
摘要
1 材料
1.1 主要仪器与器材
1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物
2 方法
2.1 IBDV病毒的扩大培养与病毒基因组dsRNA的抽提
2.2 IBDV热灭活条件的摸索
2.3 胞内dsRNA刺激实验
2.4 鸡IFN-α/β预处理DF-1细胞实验
2.5 SDS-PAGE和Western-blot分析
2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验
2.7 鸡MDA5基因的克隆、生物信息学分析及相关表达载体的构建
2.8 IBDV基因组dsRNA的生物素标记
2.9 dsRNA pulldown实验
2.10 RNA干扰
2.11 病毒滴度的测定
2.12 统计学分析
3 结果
3.1 鸡Ⅰ型干扰素预处理DF-1细胞后显著抑制IBDV的胞内复制
3.2 IBDV感染不能诱导DF-1细胞上调表达Ⅰ型干扰素
3.3 IBDV病毒蛋白与鸡MAVS不存在共定位
3.4 chIFN-α/β预处理增强IBDV感染DF-1细胞后chIFN-β的表达
3.5 IBDV基因组dsRNA是一种PAMP
3.6 鸡MDA5的克隆及有效shRNA的筛选和稳定干扰细胞的建立
3.7 鸡胞内模式识别受体MDA5介导DF-1细胞对IBDV基因组dsRNA的识别
4 讨论
第三章 VP3阻断宿主细胞干扰素-β表达的机制研究
摘要
1 材料
1.1 主要仪器与器材
1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物
2 方法
2.1 IFA
2.2 半定量RT-PCR
2.3 SDS-PAGE和Western-blot分析
2.4 病毒蛋白诱导表达系统的构建
2.5 pCMV-Flag-VP1～5及VP3突变载体的构建
2.6 VP3和VP4的原核表达
2.7 IBDV基因组dsRNA的抽提及其生物素标记
2.8 VP3和chMDA5竞争结合IBDV基因组dsRNA实验
2.9 qRT-PCR实验
2.10 免疫共沉淀实验
2.11 统计学分析
3 结果
3.1 筛选阻断dsRNA诱导chIFN-β表达的IBDV病毒蛋白
3.2 构建病毒蛋白VP1～5的诱导表达系统
3.3 过表达VPs对胞内dsRNA刺激上调chIFN-β表达的影响
3.4 VP3可结合dsRNA
3.5 K99R102K105K106共同负责VP3结合dsRNA的功能
3.6 VP3阻断胞内dsRNA诱导的chIFN-β上调表达与其dsRNA结合能力有关
3.7 VP3与chMDA5竞争结合IBDV基因组dsRNA
3.8 VP3和chMDA5不存在相互作用
4 讨论
全文总结
参考文献
第三部分 附录
附录A 全文缩略语
附录B 常用缓冲液及培养基配方
附录C 攻读博士期间学术成果
致谢
本文编号：3781377
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
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论文创新点
摘要
ABSTRACT
研究意义
技术路线
第一部分 文献综述
第一章 病毒感染与宿主抗病毒免疫研究进展
1 先天免疫在抗病毒反应过程中的作用
1.1 干扰素抗病毒作用的机制
1.2 病毒感染诱导宿主产生IFN-α/β的过程
1.2.1 RLR通路
1.2.2 TLR通路
1.3 宿主对RLR通路介导IFN-β表达的调控机制
1.3.1 泛素化修饰对于RLR抗病毒信号的调控
1.3.2 去泛素化酶对RLR抗病毒信号的调控
1.3.3 磷酸化修饰对于RLR抗病毒信号的调控
1.3.4 Ⅰ型干扰素的正反馈调节作用
2 病毒逃逸先天免疫抗病毒反应的策略
2.1 病毒抑制诱导IFN产生的信号
2.2 病毒广泛抑制宿主蛋白的表达
2.3 病毒抑制IFN下游信号的转导
2.4 病毒抑制IFN诱导产生的抗病毒蛋白活性
2.5 病毒蛋白劫持宿主泛素系统的功能
3 禽类抗病毒免疫相关模式识别受体
3.1 禽类TLR3、7、15、21
3.2 禽类RLRs
第二章 IBDV致病机制的研究进展
1 IBDV简介
1.1 IBDV的基因组特点
1.2 IBDV编码的蛋白
1.2.1 VP1蛋白
1.2.2 VP2蛋白
1.2.3 VP3蛋白
1.2.4 VP4蛋白
1.2.5 VP5蛋白
2 IBDV侵入宿主细胞的机制
2.1 病毒侵入宿主的方式
2.2 IBDV的细胞受体
2.2.1 鸡B淋巴细胞受体
2.2.2 成纤维细胞受体
2.2.3 其他细胞受体
3 IBD导致免疫抑制的机制
第二部分 研究内容
第一章 鸡MAVS的克隆及功能分析
摘要
1 材料
1.1 主要仪器与器材
1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物
2 方法
2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
2.2 总RNA的抽提和反转录反应
2.3 感受态细胞的制备
2.4 转化
2.5 DNA片段的回收
2.6 T-A克隆和序列测定
2.7 半定量RT-PCR及光密度分析
2.8 生物信息学软件对鸡MAVS结构域的预测
2.9 鸡MAVS真核表达载体及结构域缺失突变体的构建
2.10 共表达载体的构建
2.11 SDS-PAGE及Western blot分析
2.12 质粒抽提
2.13 RNA干扰
2.14 转染与激光共聚焦观察
2.15 间接免疫荧光(IFA)
2.16 荧光素酶报告基因实验
2.17 胞内Poly(I：C)刺激和荧光定量PCR(qRT-PCR)实验
2.18 病毒滴度的测定
2.19 统计学分析
3 结果
3.1 鸡MAVS的克隆、序列测定和生物信息学分析
3.2 鸡MAVS与其他物种MAVS的同源性及进化分析
3.3 chMAVS的亚细胞定位
3.4 chMAVS在chIFN-β诱生过程中的作用
3.5 chMAVS各结构域对chIFN-β表达的影响
3.6 chMAVS介导chIFN-β的诱生不需要IRF3的入核
3.7 chMAVS具有抗IBDV的功能
4 讨论
第二章 IBDV感染对宿主细胞·型干扰素系统的影响
摘要
1 材料
1.1 主要仪器与器材
1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物
2 方法
2.1 IBDV病毒的扩大培养与病毒基因组dsRNA的抽提
2.2 IBDV热灭活条件的摸索
2.3 胞内dsRNA刺激实验
2.4 鸡IFN-α/β预处理DF-1细胞实验
2.5 SDS-PAGE和Western-blot分析
2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验
2.7 鸡MDA5基因的克隆、生物信息学分析及相关表达载体的构建
2.8 IBDV基因组dsRNA的生物素标记
2.9 dsRNA pulldown实验
2.10 RNA干扰
2.11 病毒滴度的测定
2.12 统计学分析
3 结果
3.1 鸡Ⅰ型干扰素预处理DF-1细胞后显著抑制IBDV的胞内复制
3.2 IBDV感染不能诱导DF-1细胞上调表达Ⅰ型干扰素
3.3 IBDV病毒蛋白与鸡MAVS不存在共定位
3.4 chIFN-α/β预处理增强IBDV感染DF-1细胞后chIFN-β的表达
3.5 IBDV基因组dsRNA是一种PAMP
3.6 鸡MDA5的克隆及有效shRNA的筛选和稳定干扰细胞的建立
3.7 鸡胞内模式识别受体MDA5介导DF-1细胞对IBDV基因组dsRNA的识别
4 讨论
第三章 VP3阻断宿主细胞干扰素-β表达的机制研究
摘要
1 材料
1.1 主要仪器与器材
1.2 试剂、细胞、毒株和实验动物
2 方法
2.1 IFA
2.2 半定量RT-PCR
2.3 SDS-PAGE和Western-blot分析
2.4 病毒蛋白诱导表达系统的构建
2.5 pCMV-Flag-VP1～5及VP3突变载体的构建
2.6 VP3和VP4的原核表达
2.7 IBDV基因组dsRNA的抽提及其生物素标记
2.8 VP3和chMDA5竞争结合IBDV基因组dsRNA实验
2.9 qRT-PCR实验
2.10 免疫共沉淀实验
2.11 统计学分析
3 结果
3.1 筛选阻断dsRNA诱导chIFN-β表达的IBDV病毒蛋白
3.2 构建病毒蛋白VP1～5的诱导表达系统
3.3 过表达VPs对胞内dsRNA刺激上调chIFN-β表达的影响
3.4 VP3可结合dsRNA
3.5 K99R102K105K106共同负责VP3结合dsRNA的功能
3.6 VP3阻断胞内dsRNA诱导的chIFN-β上调表达与其dsRNA结合能力有关
3.7 VP3与chMDA5竞争结合IBDV基因组dsRNA
3.8 VP3和chMDA5不存在相互作用
4 讨论
全文总结
参考文献
第三部分 附录
附录A 全文缩略语
附录B 常用缓冲液及培养基配方
附录C 攻读博士期间学术成果
致谢
本文编号：3781377
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3781377.html
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