牛布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的建立及应用

发布时间：2023-04-04 04:11

　　为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B. abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形式表达。经条件优化建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA(iELISA)方法,结果显示,iELISA最佳反应条件为:抗原HSP70包被浓度为0.2μg/孔,血清稀释度为1200,封闭液为5%脱脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀释度为14 000,显色10 min;该iELISA方法的临界值为0.186。特异性试验结果显示,除布鲁氏菌病阳性血清外,该iELISA与IBR、BVD和FMD阳性血清无明显交叉反应;敏感性试验结果显示,血清1400稀释时仍能有效检出布鲁氏菌;重复性试验结果显示。批内批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的iELISA方法与传统的虎红凝集和试管凝集试验同时对血清样品进行检测,比分析检测结果,结果显示该iELISA方法与其它两者符合率较高。利用本方法对秦皇岛未进行布鲁氏菌病免疫的规模...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 主要实验材料
    1.2 重组表达载体和表达菌株的构建
    1.3 重组蛋白的诱导表达及检测
    1.4 检测牛布鲁氏菌抗体的iELISA方法的优化
    1.5 i ELISA方法临界值（CUT OFF）的确定
    1.6 iELISA方法的特异性试验
    1.7 i ELISA方法的敏感性试验
    1.8 iELISA方法的重复性试验
    1.9 与经典方法的比较及初步应用试验
2 结果
    2.1 HSP70基因的扩增及重组质粒pET32a-HSP70鉴定
    2.2 重组蛋白的表达、鉴定及纯化
    2.3 iELISA方法的优化结果
    2.4 临界值的确定
    2.5 iELISA方法的特异性分析
    2.6 iELISA的敏感性分析
    2.7 iELISA方法的重复性试验
    2.8 与经典方法的比较及初步应用
3 讨论



本文编号：3781758