副猪嗜血杆菌脂蛋白PalA基因的克隆及生物信息学分析
发布时间：2023-04-16 14:26
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属的成员,为革兰氏阴性菌,是革拉泽氏病(Glaesser’s Disease)的主要病原菌。研究表明HPS常在与猪繁殖与呼吸综合症病毒等病的病原混合感染时对机体造成免疫抑制,从而加重感染发病,给养猪业带来重大的经济损失,严重威胁到养猪产业的健康发展。脂蛋白PalA作为HPS的重要毒力因子之一,是细胞膜脂蛋白与肽聚糖相互作用结合的一类蛋白,广泛的存在于革兰氏阴性细菌中,可作为疫苗的候选蛋白。本研究以三株副猪嗜血杆菌四川分离株为材料,进行PalA基因PCR扩增,构建该基因的克隆载体及5型菌株PalA基因的表达载体并进行生物信息学分析。 Ⅰ、副猪嗜血杆菌的分离鉴定 对来自四川省遂宁市模化养殖场中疑似副猪嗜血杆菌(HPS)感染的发病猪的肺脏等病料组织,做无菌处理后,划线方式涂布于TSA培养基,挑取菌落形态特征与副猪嗜血杆菌相似的单个菌落接种TSA培养基,经三次传代纯化后进行形态学鉴定、染色镜检及培养特性检测、生化试验、血清型试验等基本生物学特性研究。 Ⅱ、PalA基因的克隆与序列分析 参照GenBank收录...
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 文献综述
1.1. 副猪嗜血杆菌研究进展
1.1.1. 病原学和血清学研究进展
1.1.2. 基因分型研究
1.1.3. 细菌分离鉴定与培养
1.1.4. 致病机理
1.1.5. 副猪嗜血杆菌毒力因子的研究
1.1.6. 临床用药的研究
1.1.7. 预防和免疫
1.2. 生物信息学在病原研究中的应用
1.3. 课题研究的目的和意义
2. 材料和设备
2.1. 试验材料
2.1.1. 病料
2.1.2. 试验所涉及的菌株和质粒
2.1.3. 试验所涉及的酶，试剂盒及生化试剂
2.2. 主要仪器设备
2.3. 分析软件及网站
3. 实验方法
3.1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
3.1.1. 培养基的制备
3.1.2. 细菌的分离培养
3.1.3. NAD依赖性试验
3.1.4. CAMP试验
3.1.5. 生化试验
3.1.6. 血清型鉴定
3.2. PalA基因的克隆
3.2.1. PalA基因的引物设计与合成
3.2.2. PaLA基因的PCR扩增
3.2.3. PaLA基因PCR扩增产物胶回收
3.2.4. PCR纯化产物与pMD19-T Vector连接
3.2.5. DH5α感受态细胞的制备(CaCl2法)
3.2.6. 连接产物的转化
3.2.7. 重组质粒提取
3.2.8. 重组质粒测序
3.2.9. 重组质粒的双酶切
3.3. pET32a-PalA表达载体的构建
3.3.1. 表达载体pET32a进行双酶切
3.3.2. 目的片段与载体片段的连接
3.3.3. 载体质粒的修复转化到DH5α及阳性菌株的筛选
3.3.4. 表达载体质粒的提取
3.3.5. 重组质粒测序
3.3.6. BL21感受态细胞的制备(CaCl2法)
3.3.7. 重组表达载体的转化
3.3.8. 阳性检测
3.4. 生物信息学分析
3.4.1. ORF的查找分析
3.4.2. 蛋白质理化性质分析
3.4.3. 蛋白质的疏水性分析
3.4.4. 蛋白质跨膜区分析
3.4.5. 蛋白质的主要抗原域预测
3.4.6. 蛋白质的表面可能性预测
3.4.7. 蛋白质的信号肽预测
3.4.8. 氨基酸二级结构的预测
3.4.9. 蛋白质三维结构预测
3.4.10. 序列同源性和相似性搜索
3.4.11. 多序列比对和系统进化树的建立
4. 结果与分析
4.1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
4.1.1. 细菌的分离培养特性
4.1.2. 细菌的鉴定结果
4.1.3. 血清型鉴定
4.2. HPS四川分离株PaLA基因的克隆
4.2.1. PaLA基因的PCR扩增
4.2.2. pMD19-T-PalA克隆载体的获得
4.3. pET32a-PalA表达载体的构建
4.3.1. 重组表达载体pET32a-PalA的获得
4.3.2. 表达菌株BL21(pET32a-PalA)的获得
4.4. HPS-PalA生物信息学分析
4.4.1. HPS-PalA基因编码氨基酸序列基本理化性质的分析
4.4.2. HPS-PalA基因编码蛋白质的疏水性分析
4.4.3. 跨膜区分析
4.4.4. PalA基因编码蛋白质的主要抗原域预测
4.4.5. HPS-PalA基因编码蛋白质的表面可能性预测
4.4.6. HPS-PalA基因编码蛋白信号肽预测
4.4.7. HPS-PalA基因编码蛋白质的二级结构预测
4.4.8. 蛋白质三维结构预测
4.4.9. 进化树分析
5. 讨论
5.1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
5.2. PaLA基因的PCR扩增及克隆
5.3. pET32a-PalA表达载体的构建
5.4. PaLA基因的生物信息学分析
6. 结论
参考文献
致谢
本文编号：3791441
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 文献综述
1.1. 副猪嗜血杆菌研究进展
1.1.1. 病原学和血清学研究进展
1.1.2. 基因分型研究
1.1.3. 细菌分离鉴定与培养
1.1.4. 致病机理
1.1.5. 副猪嗜血杆菌毒力因子的研究
1.1.6. 临床用药的研究
1.1.7. 预防和免疫
1.2. 生物信息学在病原研究中的应用
1.3. 课题研究的目的和意义
2. 材料和设备
2.1. 试验材料
2.1.1. 病料
2.1.2. 试验所涉及的菌株和质粒
2.1.3. 试验所涉及的酶，试剂盒及生化试剂
2.2. 主要仪器设备
2.3. 分析软件及网站
3. 实验方法
3.1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
3.1.1. 培养基的制备
3.1.2. 细菌的分离培养
3.1.3. NAD依赖性试验
3.1.4. CAMP试验
3.1.5. 生化试验
3.1.6. 血清型鉴定
3.2. PalA基因的克隆
3.2.1. PalA基因的引物设计与合成
3.2.2. PaLA基因的PCR扩增
3.2.3. PaLA基因PCR扩增产物胶回收
3.2.4. PCR纯化产物与pMD19-T Vector连接
3.2.5. DH5α感受态细胞的制备(CaCl2法)
3.2.6. 连接产物的转化
3.2.7. 重组质粒提取
3.2.8. 重组质粒测序
3.2.9. 重组质粒的双酶切
3.3. pET32a-PalA表达载体的构建
3.3.1. 表达载体pET32a进行双酶切
3.3.2. 目的片段与载体片段的连接
3.3.3. 载体质粒的修复转化到DH5α及阳性菌株的筛选
3.3.4. 表达载体质粒的提取
3.3.5. 重组质粒测序
3.3.6. BL21感受态细胞的制备(CaCl2法)
3.3.7. 重组表达载体的转化
3.3.8. 阳性检测
3.4. 生物信息学分析
3.4.1. ORF的查找分析
3.4.2. 蛋白质理化性质分析
3.4.3. 蛋白质的疏水性分析
3.4.4. 蛋白质跨膜区分析
3.4.5. 蛋白质的主要抗原域预测
3.4.6. 蛋白质的表面可能性预测
3.4.7. 蛋白质的信号肽预测
3.4.8. 氨基酸二级结构的预测
3.4.9. 蛋白质三维结构预测
3.4.10. 序列同源性和相似性搜索
3.4.11. 多序列比对和系统进化树的建立
4. 结果与分析
4.1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
4.1.1. 细菌的分离培养特性
4.1.2. 细菌的鉴定结果
4.1.3. 血清型鉴定
4.2. HPS四川分离株PaLA基因的克隆
4.2.1. PaLA基因的PCR扩增
4.2.2. pMD19-T-PalA克隆载体的获得
4.3. pET32a-PalA表达载体的构建
4.3.1. 重组表达载体pET32a-PalA的获得
4.3.2. 表达菌株BL21(pET32a-PalA)的获得
4.4. HPS-PalA生物信息学分析
4.4.1. HPS-PalA基因编码氨基酸序列基本理化性质的分析
4.4.2. HPS-PalA基因编码蛋白质的疏水性分析
4.4.3. 跨膜区分析
4.4.4. PalA基因编码蛋白质的主要抗原域预测
4.4.5. HPS-PalA基因编码蛋白质的表面可能性预测
4.4.6. HPS-PalA基因编码蛋白信号肽预测
4.4.7. HPS-PalA基因编码蛋白质的二级结构预测
4.4.8. 蛋白质三维结构预测
4.4.9. 进化树分析
5. 讨论
5.1. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定
5.2. PaLA基因的PCR扩增及克隆
5.3. pET32a-PalA表达载体的构建
5.4. PaLA基因的生物信息学分析
6. 结论
参考文献
致谢
本文编号：3791441
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