非洲猪瘟病毒核酸双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建

发布时间：2023-04-16 14:27

　　研究在利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的TaqMan荧光定量PCR方法基础上,增加内标物TaqMan荧光,通过优化反应体系及条件,进行Real-time PCR扩增,建立了一种快速、准确、特异性好的非洲猪瘟病毒核酸双重TaqMan探针荧光定量PCR技术,并进行敏感性、稳定性和特异性评价及比较。结果显示:荧光定量PCR标准曲线线性关系良好,R²值可达到1,敏感性最低能检测到28个拷贝数/μL,比常规PCR方法高40～80倍;通过5份标准质粒重复检测3次,每一个样品重复检测Ct值一致,稳定性良好,变异系数范围0.70%～2.51%;同时每一个样品反应体系中内标物(pUC57-actin)Ct值一致,变异系数范围0.25%～3.44%,因此双重验证了该方法的稳定性;特异性试验证明与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)基因组无交叉反应。该方法具有提升准确率和判断监测体系内是否存在干扰物的优点,可以防止样品出现假阴性;适合于血清样品、组织样品和疫苗样品的非洲猪瘟病毒核酸检测。

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 试验试剂
    1.2 试验仪器
    1.3 病毒
    1.4 非洲猪瘟病毒阳性质粒合成和引物合成
    1.5 内标质粒合成和引物合成
    1.6 双重Taq Man实时荧光定量PCR体系的建立与优化
    1.7 双重Taq Man实时荧光定量PCR标准曲线的建立
    1.8 双重Taq Man实时荧光定量PCR敏感性试验、特异性试验、稳定性试验
        1.8.1 特异性试验
        1.8.2 敏感性试验
        1.8.3 稳定性试验
2 结果与分析
    2.1 双重Taq Man实时荧光定量PCR体系的建立与优化
    2.2 双重Taq Man实时荧光定量PCR标准曲线的建立
    2.3 双重Taq Man实时荧光定量PCR特异性试验、敏感性试验和稳定性试验
        2.3.1 特异性试验
        2.3.2 敏感性试验
        2.3.3 稳定性试验
3 讨论
4 结论



本文编号：3791443