应用CRISPR/Cas9技术快速敲除伪狂犬病毒毒力基因的研究

发布时间：2023-04-16 22:54

　　伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又名奥耶兹氏病,是由猪疱疹病毒I型(Suid heipesvirus I,SuHV-I)亦称伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种烈性传染病。免疫接种经典PRV Bartha-K61弱毒疫苗是防控伪狂犬病的有效途径之一。然而,近年来在我国很多地区的伪狂犬病疫苗免疫猪群中接连爆发了新的伪狂犬病疫情。研究表明,目前流行的伪狂犬病病毒(PRV)为变异株,这些变异株属于PRV基因II型。传统的Bartha-K61疫苗不能针对当前流行的变异株提供完全的保护。因此,需要对当前流行的PRV变异株进行快速致弱以及对PRV进行有效的防控。成簇规律间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)RNA系统是一种广泛存在于细菌和古细菌中的由RNA介导的可遗传性的获得性免疫系统,这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源基因(如噬菌体质粒)的免疫功能。在II型CRISPR系统中CRISPR-Derived RNA(crRNA)通过...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略表
前言
第一章 文献综述
    1.1 伪狂犬病
        1.1.1 伪狂犬病病毒
        1.1.2 病原学
        1.1.3 病毒的分子生物学特点
        1.1.4 伪狂犬病在我国流行趋势
        1.1.5 PRV的临床症状
        1.1.6 PRV疫苗研究进展及防御措施
    1.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统
        1.2.1 CRISPR/Cas9的简介
        1.2.2 CRISPR/Cas9工作原理
    1.3 研究目的与意义
第二章 有效sgRNA的筛选
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 结果
        2.2.1 sgRNA质粒的构建
        2.2.2 CRISPR/Cas9载体功能验证
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 非同源末端连接修复及其效率检测
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 gE基因缺失病毒毒株的筛选与毒力实验
    4.1 材料方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果
        4.2.1 PCR反应验证gE基因缺失病毒毒株
        4.2.2 蛋白表达验证PRV gE基因缺失突变毒株
        4.2.3 gE基因缺失病毒体外生长实验
        4.2.4 PRV gE基因缺失毒株病毒的毒力实验
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 gE/gI及gE/gI/TK基因缺失毒株构建及体外实验与病毒毒力及免疫保护实验
    5.1 材料方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 方法
    5.2 结果
        5.2.1 gE/gI双基因缺失病毒筛选与纯化
        5.2.2 gE/gI双基因缺失病毒体外生长实验
        5.2.3 gE/gI双基因缺失毒株病毒的毒力实验
        5.2.4 gE/gI/TK三基因缺失病毒的筛选与纯化
        5.2.5 gE/gI/TK三基因缺失病毒体外生长实验
        5.2.6 gE/gI/TK三基因缺失毒株病毒的毒力及免疫保护实验
    5.3 讨论
    5.4 小结
结论
参考文献
附录
作者简介
致谢



本文编号：3792047