bta-miR-141靶向SIRT1调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢的研究
发布时间：2023-04-18 21:12
奶牛乳腺乳脂代谢受到诸多因素的调控,是十分复杂的过程。SIRT1基因是具有乙酰化作用的沉默信息调控子。SIRT1基因在脂肪细胞中高表达,在部分哺乳动物体内起到抑制脂肪生成的作用。目前关于SIRT1基因在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂代谢调控作用的研究报道较少。MicroRNA(miRNA)是一类转录后调控的非编码RNA,其可以通过调控靶基因的表达而间接地影响乳脂代谢过程。本实验室前期利用高通量测序技术分别对泌乳前7天和泌乳180天奶牛乳腺组织中miRNA的表达模式进行鉴定,分析得到bta-miR-141显著差异表达(P<0.05)。生物信息学分析表明,bta-miR-141靶向调控SIRT1基因。本研究以奶牛乳腺上皮细胞及人肾上皮细胞系(293T)为研究对象,运用甘油三酯含量测定、油红O染色、荧光定量PCR(qRT-PCR)、双荧光素酶报告基因以及免疫印迹等试验技术,研究bta-miR-141靶向SIRT1基因调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢的机制。所得结果如下:1、bta-miR-141功能探究:奶牛乳腺上皮细胞中分别转染miR-141模拟物(mimic)、阴性对照(mimic-NC)。...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
常用词语缩写
第一章 文献综述
1 乳脂肪概述
1.1 乳脂肪合成途径
1.2 乳脂肪合成关键转录因子的研究进展
2 Sirtuin家族及SIRT1基因的研究进展
2.1 Sirtuin家族基因的结构特征
2.2 Sirtuin家族基因的功能概述
2.3 Sirtuin家族基因对组织、器官以及个体发育的影响
2.4 Sirtuin家族成员的应用及发展方向
2.5 去乙酰化酶SIRT1的结构、表达与定位
2.6 SIRT1基因与脂代谢
2.7 SIRT1 -SREBP-1c通路
2.8 SIRT1 -PGC-1α通路
3 microRNA与乳脂代谢
3.1 microRNA的生物合成
3.2 microRNA的作用机制
3.3 microRNA的调控功能研究
3.4 microRNA在动物脂肪组织及乳腺组织中的研究
3.5 microRNA的靶基因预测与验证
3.6 miR-141的研究进展
4 研究的目的、研究思路及技术路线
4.1 研究的目的与意义
4.2 研究思路
4.3 技术路线
第二章 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮细胞中的功能探究
1 材料与方法
1.1 试验试剂与配置、仪器
1.2 试验细胞
1.3 引物
1.4 奶牛乳腺上皮细胞的培养
1.4.1 细胞复苏
1.4.2 细胞传代
1.4.3 细胞冻存
1.5 差异表达miRNA的生物信息学筛选
1.6 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮细胞中的转染
1.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
1.7.1 细胞总RNA的提取
1.7.2 琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量
1.7.3 mRNA反转录成cDNA
1.7.4 miRNA反转录成cDNA
1.7.5 Real-time PCR
1.8 甘油三酯测定
1.9 油红O染色
1.10 统计分析
2 结果
2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养
2.2 qRT-PCR检测牛乳腺上皮细胞中miR-141的过表达和抑制表达效果
2.3 转染miR-141 mimic后甘油三酯测定
2.4 转染miR-141 mimic后油红O染色
3 讨论
4 小结
第三章 bta-miR-141靶向SIRT1调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢
1 试验准备
1.1 试验试剂与仪器
1.2 试验细胞
2 试验方法
2.1 双荧光素酶报告基因验证miRNA对SIRT1基因的靶向作用
2.1.1 牛SIRT1基因野生型重组质粒构建
2.1.2 SIRT1基因3'UTR区片段的扩增及纯化
2.1.3 PCR产物的双酶切、回收纯化与连接
2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备、连接和转化
2.1.5 重组质粒的测序鉴定
2.1.6 牛SIRT1基因突变载体的构建
2.1.7 双荧光素酶报告基因活性检测试验
2.2 荧光定量PCR反应
2.3 Western Blot验证miRNA对SIRT1基因的靶向作用
2.3.1 蛋白样品制备
2.3.2 蛋白定量试验(BCA试验)
2.3.3 SDS-PAGE电泳
2.3.4 转膜
2.3.5 免疫杂交封闭
2.3.6 显色与Western Blot图像分析
2.4 SIRT1基因的功能研究
2.4.1 靶向干扰SIRT1基因的siRNA序列的设计及合成
2.4.2 siRNA敲降SIRT1效率验证
2.4.3 siRNA与miR-141 mimic共转染对乳脂代谢相关基因表达量的影响
2.5 统计分析
3 研究结果
3.1 双荧光素酶报告基因结果显示miR-141对SIRT1基因的靶向作用
3.1.1 菌落PCR产物电泳结果
3.1.2 阳性克隆测序结果
3.1.3 野生型载体突变
3.1.4 miR-141与SIRT1 3'UTR区靶位点双荧光素酶报告基因的检测结果
3.2 过表达/抑制表达miR-141影响SIRT1基因及乳脂代谢相关基因的表达
3.3 过表达miR-141影响SIRT1蛋白表达
3.4 SIRT1基因的功能研究
3.4.1 siRNA敲降SIRT1效率验证
3.4.2 siSIRT1与miR-141 mimic共转染对乳脂代谢相关基因表达量的影响
4 讨论
5 小结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
本文编号：3793045
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
常用词语缩写
第一章 文献综述
1 乳脂肪概述
1.1 乳脂肪合成途径
1.2 乳脂肪合成关键转录因子的研究进展
2 Sirtuin家族及SIRT1基因的研究进展
2.1 Sirtuin家族基因的结构特征
2.2 Sirtuin家族基因的功能概述
2.3 Sirtuin家族基因对组织、器官以及个体发育的影响
2.4 Sirtuin家族成员的应用及发展方向
2.5 去乙酰化酶SIRT1的结构、表达与定位
2.6 SIRT1基因与脂代谢
2.7 SIRT1 -SREBP-1c通路
2.8 SIRT1 -PGC-1α通路
3 microRNA与乳脂代谢
3.1 microRNA的生物合成
3.2 microRNA的作用机制
3.3 microRNA的调控功能研究
3.4 microRNA在动物脂肪组织及乳腺组织中的研究
3.5 microRNA的靶基因预测与验证
3.6 miR-141的研究进展
4 研究的目的、研究思路及技术路线
4.1 研究的目的与意义
4.2 研究思路
4.3 技术路线
第二章 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮细胞中的功能探究
1 材料与方法
1.1 试验试剂与配置、仪器
1.2 试验细胞
1.3 引物
1.4 奶牛乳腺上皮细胞的培养
1.4.1 细胞复苏
1.4.2 细胞传代
1.4.3 细胞冻存
1.5 差异表达miRNA的生物信息学筛选
1.6 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮细胞中的转染
1.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
1.7.1 细胞总RNA的提取
1.7.2 琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量
1.7.3 mRNA反转录成cDNA
1.7.4 miRNA反转录成cDNA
1.7.5 Real-time PCR
1.8 甘油三酯测定
1.9 油红O染色
1.10 统计分析
2 结果
2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养
2.2 qRT-PCR检测牛乳腺上皮细胞中miR-141的过表达和抑制表达效果
2.3 转染miR-141 mimic后甘油三酯测定
2.4 转染miR-141 mimic后油红O染色
3 讨论
4 小结
第三章 bta-miR-141靶向SIRT1调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢
1 试验准备
1.1 试验试剂与仪器
1.2 试验细胞
2 试验方法
2.1 双荧光素酶报告基因验证miRNA对SIRT1基因的靶向作用
2.1.1 牛SIRT1基因野生型重组质粒构建
2.1.2 SIRT1基因3'UTR区片段的扩增及纯化
2.1.3 PCR产物的双酶切、回收纯化与连接
2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备、连接和转化
2.1.5 重组质粒的测序鉴定
2.1.6 牛SIRT1基因突变载体的构建
2.1.7 双荧光素酶报告基因活性检测试验
2.2 荧光定量PCR反应
2.3 Western Blot验证miRNA对SIRT1基因的靶向作用
2.3.1 蛋白样品制备
2.3.2 蛋白定量试验(BCA试验)
2.3.3 SDS-PAGE电泳
2.3.4 转膜
2.3.5 免疫杂交封闭
2.3.6 显色与Western Blot图像分析
2.4 SIRT1基因的功能研究
2.4.1 靶向干扰SIRT1基因的siRNA序列的设计及合成
2.4.2 siRNA敲降SIRT1效率验证
2.4.3 siRNA与miR-141 mimic共转染对乳脂代谢相关基因表达量的影响
2.5 统计分析
3 研究结果
3.1 双荧光素酶报告基因结果显示miR-141对SIRT1基因的靶向作用
3.1.1 菌落PCR产物电泳结果
3.1.2 阳性克隆测序结果
3.1.3 野生型载体突变
3.1.4 miR-141与SIRT1 3'UTR区靶位点双荧光素酶报告基因的检测结果
3.2 过表达/抑制表达miR-141影响SIRT1基因及乳脂代谢相关基因的表达
3.3 过表达miR-141影响SIRT1蛋白表达
3.4 SIRT1基因的功能研究
3.4.1 siRNA敲降SIRT1效率验证
3.4.2 siSIRT1与miR-141 mimic共转染对乳脂代谢相关基因表达量的影响
4 讨论
5 小结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
本文编号：3793045
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3793045.html
