金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺纤维化MMPs/TIMPS和uPA系统的表达及其信号通路的研究

发布时间：2023-04-21 20:42

　　奶牛乳腺纤维化是一种以细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积和肌成纤维细胞过度增殖为特征的疾病。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是导致奶牛慢性乳腺炎的主要病原菌之一,其持续感染引起乳腺结构损伤,进而发展为纤维化,甚至乳腺硬化。本课题组前期的研究均未涉及到调控ECM降解代谢的内容,也未见国内外的相关研究报道。因此,本文通过体内和体外研究S.aureus诱导乳腺纤维化过程中MMPs/TIMPs与uPA系统的表达以及其相关通路,以探讨S.aureus诱导乳腺纤维化的分子机制。本试验采用0、105、106、108 CFU/mL热灭活的S.aureus菌液作用于体外培养的BMFBs和BMECs,于6 h、12 h、24 h、48 h提取细胞的总RNA和总蛋白,通过qPCR、Western blot 方法检测 MMP-1、-2、-3、-9、-13、TIMP-1、-2、uPA、uPAR、PAI-1和COL I mRNA和蛋白的表达水平,并通过胶原酶谱试验检测细胞液上清液中MMP-2和-9的活性;筛选106 CFU/mL热灭...

【文章页数】：179 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
1 引言
    1.1 组织器官纤维化的机制
    1.2 S.aureus与奶牛乳腺纤维化
    1.3 MMPs/TIMPs的简介
        1.3.1 MMPs的结构和分类
        1.3.2 MMPs的调控
        1.3.3 MMPs在纤维化中的生物学作用
    1.4 uPA系统简介
        1.4.1 uPA的结构特点
        1.4.2 uPAR的结构特点
        1.4.3 PAI的结构特点
        1.4.4 uPA系统的生物学功能
    1.5 转录组学在乳腺纤维化研究中的应用
    1.6 MAPK信号通路
        1.6.1 MAPK信号通路概述
        1.6.2 MAPKs的组成
    1.7 本研究的目的及意义
        1.7.1 本研究的目的
        1.7.2 本研究的意义
2 研究一 S.aureus对BMFBs MMPs/TIMPs和uPA系统表达及其信号通路的影响
    2.1 S.aureus对BMFBs MMPs/TIMPs和uPA系统表达的影响
        2.1.1 试验材料与仪器
        2.1.2 试验方法
        2.1.3 试验结果
        2.1.4 分析与小结
    2.2 热灭活S.aureus作用BMFBs的转录组测序
        2.2.1 试验材料与仪器
        2.2.2 试验方法
        2.2.3 试验结果
        2.2.4 分析与小结
    2.3 MAPK通路在S.aureus诱导BMFBs MMP-2、TIMP-1/2和uPA/PAI-1的表达的影响
        2.3.1 试验材料与仪器
        2.3.2 试验方法
        2.3.3 试验结果
        2.3.4 分析与小结
    2.4 讨论
        2.4.1 S.aureus对BMFBs MMPs/TIMPs表达的影响
        2.4.2 S.aureus对BMFBs uPA系统表达的影响
        2.4.3 转录组学分析S.aureus诱导BMFBs纤维化相关基因的表达
        2.4.4 MAPKs信号通路S. aureus诱导MMPs/TIMPs和uPA系统的作用
3 研究二 S. aureus诱导BMECs MMPs/TIMPs和uPA系统表达的影响
    3.1 材料
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 主要试剂和试剂盒
        3.1.3 主要仪器与设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 热灭活S.aureus菌液的制备
        3.2.2 BMECs的复苏与培养
        3.2.3 不同浓度热灭活的菌液处理细胞
        3.2.4 荧光定量PCR检测MMPs/TIMPs、uPA系统和COL Ⅰ mRNA表达情况
        3.2.5 Western blot检测MMPs/TIMPs,uPA系统和COL Ⅰ蛋白表达情况
        3.2.6 数据分析与处理
    3.3 结果
        3.3.1 qPCR扩增产物基因特异性检测结果
        3.3.2 S.aureus对BMECs MMPs表达的影响
        3.3.3 S.aureus对BMECs TIMPs表达的影响
        3.3.4 S.aureus对BMECs uPA系统表达的影响
        3.3.5 S.aureus对BMECs COL Ⅰ mRNA和蛋白表达的影响
        3.3.6 S.aureus对BMECs MMP-2/MMP-9活性的影响
        3.3.7 BMECs中MMPs/TIMPs、uPA系统与COL Ⅰ之间相关趋势分析
    3.4 讨论
        3.4.1 S.aureus对BMECs MMPs/TIMPs表达的影响
        3.4.2 S.aureus对BMECs uPA系统表达的影响
    3.5 分析与小结
4 研究三 S.aureus诱导小鼠乳腺纤维化MMPs/TIMPs和uPA系统表达的影响
    4.1 试验材料与仪器
        4.1.1 S.aureus菌株
        4.1.2 实验动物
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 主要仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 菌液的制备
        4.2.2 感染小鼠试验
        4.2.3 Masson三色染色
        4.2.4 S.aureus感染小鼠乳腺组织中MMPs/TIMPs和uPA/PAI-1的表达及定位
        4.2.5 荧光定量PCR检测小鼠乳腺组织中MMPs/TIMPs,uPA系统mRNA表达情况
        4.2.6 试验结果处理
    4.3 结果
        4.3.1 小鼠乳腺组织Masson三色染色结果
        4.3.2 S.aureus对小鼠乳腺组织中MMPs/TIMP-1和uPA/PAI-1 mRNA的表达结果
        4.3.3 S.aureus诱导小鼠乳腺MMPs/TIMP-1和uPA/PAI-1的表达分布结果
    4.4 讨论
        4.4.1 S.aureus对小鼠乳腺组织中MMP-1、-3、-13/TIMP-1表达的影响
        4.4.2 S.aureus对小鼠乳腺组织中uPA/PAI-1表达的影响
    4.5 分析与小结
5 全文讨论
    5.1 S.aureus对MMPs/TIMPs及uPA系统表达的影响
    5.2 S.aureus对uPA系统表达的影响
    5.3 MAPKs信号通路在段aureus促进BMFBs MMP-2/TIMP-1、-2及uPA/PAI-1表达的作用
6 全文结论
7 创新点
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3796209