新城疫假型病毒制备应用及HN单链抗体表达活性鉴定
发布时间：2023-04-22 08:36
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的危害养禽业的一种主要传染病。NDV能够感染大多数鸟类,速发型NDV为A类病原,一旦发生需要向世界动物卫生组织(OIE)报告。ND的爆发导致了严格的封港禁运。NDV是副粘病毒亚科的一名成员,RNA基因组为单股负链。目前主要采用基于NDV的中和试验来检测鸡血清中抗NDV的中和抗体,但这种传统的中和抗体检测方法耗时较长且主观,因此本研究希望通过构建NDV的假型化病毒,建立依赖于NDV假型病毒的新型中和试验方法来检测鸡血清中抗NDV的中和抗体。本研究主要构建了 NDV囊膜蛋白血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)包裹HIV-Luciferase(HIV-Luc)骨架构建感染性假型病毒,建立了采用NDV假型化HIV-Luc假型病毒来评价NDV中和抗体效价的新型中和试验方法,并且可替代传统中和试验进行血清抗NDV中和抗体评价。此外为检测NDV的HN蛋白,本研究还制备了抗NDV HN的单链抗体(scFv)并验证了其生物学活性。1新城疫病毒假型病毒体系的构建及生物活性分析本实验通过以NDV囊膜蛋白HN和F包裹HIV-Luc骨架构建感染性假型病毒,并深入研...
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
本文部分缩写的中英文对照
摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
第一章 新城疫病毒研究综述
1 新城疫概况
2 NDV形态及其基因组结构
3 NDV各结构蛋白特征
3.1 融合蛋白(F)
3.2 血凝素——神经氨酸酶蛋白(HN)
3.3 基质蛋白(M)
3.4 核衣壳蛋白(NP)
3.5 磷蛋白(P)
3.6 大分子蛋白(L)
4 NDV的生物学特征
5 抗NDV抗体检测
5.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
5.2 中和试验(neutralization tests)
5.3 琼脂凝胶扩散试验(AGID)
5.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
第二章 假型病毒的应用研究进展
1 假型病毒生物学特征
2 假型病毒的包装制备
3 假型病毒的实验室及临床应用
3.1 假型病毒宿主细胞嗜性及靶向应用
3.2 假型病毒介导的基因转导
3.3 假型病毒用于中和抗体效价评价
3.4 假型病毒的基因治疗
第三章 单链抗体应用研究进展
1 单链抗体结构
2 scFv的构建
3 scFv的表达
3.1 scFv在细菌中的表达
3.2 scFv在酵母细胞中的表达
3.3 scFv在哺乳动物细胞中的表达
4 scFv的应用
4.1 scFv在检测中的应用
4.2 scFv的中和作用
4.3 scFv的靶向作用
4.4 scFv的基因治疗作用
4.5 scFv在诊断中的应用
第二篇 试验研究
第一章 新城疫病毒假型病毒体系的构建
1 材料
1.1 细胞、病毒
1.2 主要试剂及仪器
2 方法
2.1 病毒RNA提取和cDNA合成
2.2 PCR引物的设计
2.3 PCR扩增NDV的HN和F基因
2.4 PCR扩增VCT/HN、VCT-HN、F/VCT和FACT基因
2.5 重组真核表达质粒的构建
2.6 重组膜蛋白真核表达质粒鉴定
2.7 重组膜蛋白真核表达质粒表达鉴定
2.8 NDV假型病毒的包装及收获
2.9 NDV假型病毒中HN和F蛋白的鉴定
2.10 NDV假型病毒感染293T细胞与Luc荧光活性检测
2.11 HIV-1 P24抗原定量假型病毒
2.12 NDV病毒和NDV假型病毒TCID50测定
2.13 建立NDV假型病毒中和试验
2.14 NDV假型病毒中和试验与传统中和试验的比较
3 结果与分析
3.1 HN和F基因的克隆
3.2 VCT/HN、VCT-HN、F/VCT和FACT基因片段的的扩增
3.3 重组真核表达质粒的构建和鉴定
3.4 重组真核表达质粒的表达鉴定
3.5 NDV假型病毒粒子中HN和F蛋白的ELISA检测
3.6 NDV假型病毒感染293T细胞后的Luciferase活性检测
3.7 影响NDV假型化HIV-Luc假型病毒感染效率的因素
3.8 NDV假型病毒中和试验的建立
3.9 NDV假型化HIV-Luc假型病毒中和试验的验证
4 讨论
第二章 抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体的原核表达及其功能鉴定
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
1.2 杂交瘤细胞总RNA的提取和反转录
1.3 抗体全长基因的扩增及其可变区分析
1.4 VL和VH的PCR扩增
1.5 HN-scFv原核重组表达质粒的构建
1.6 重组蛋白的诱导表达及鉴定
1.7 包涵体复性和纯化
1.8 复性蛋白活性检测
2 结果
2.1 全长抗HN McAb轻链和重链基因的克隆
2.2 抗体可变区VL和VH分析
2.3 HN-scFv原核表达质粒的构建和鉴定
2.4 HN-scFv的诱导表达及复性、纯化
2.5 HN-scFv的功能检测
3 讨论
第三篇 全文结论
参考文献
致谢
本文编号：3797296
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
本文部分缩写的中英文对照
摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
第一章 新城疫病毒研究综述
1 新城疫概况
2 NDV形态及其基因组结构
3 NDV各结构蛋白特征
3.1 融合蛋白(F)
3.2 血凝素——神经氨酸酶蛋白(HN)
3.3 基质蛋白(M)
3.4 核衣壳蛋白(NP)
3.5 磷蛋白(P)
3.6 大分子蛋白(L)
4 NDV的生物学特征
5 抗NDV抗体检测
5.1 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验
5.2 中和试验(neutralization tests)
5.3 琼脂凝胶扩散试验(AGID)
5.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
第二章 假型病毒的应用研究进展
1 假型病毒生物学特征
2 假型病毒的包装制备
3 假型病毒的实验室及临床应用
3.1 假型病毒宿主细胞嗜性及靶向应用
3.2 假型病毒介导的基因转导
3.3 假型病毒用于中和抗体效价评价
3.4 假型病毒的基因治疗
第三章 单链抗体应用研究进展
1 单链抗体结构
2 scFv的构建
3 scFv的表达
3.1 scFv在细菌中的表达
3.2 scFv在酵母细胞中的表达
3.3 scFv在哺乳动物细胞中的表达
4 scFv的应用
4.1 scFv在检测中的应用
4.2 scFv的中和作用
4.3 scFv的靶向作用
4.4 scFv的基因治疗作用
4.5 scFv在诊断中的应用
第二篇 试验研究
第一章 新城疫病毒假型病毒体系的构建
1 材料
1.1 细胞、病毒
1.2 主要试剂及仪器
2 方法
2.1 病毒RNA提取和cDNA合成
2.2 PCR引物的设计
2.3 PCR扩增NDV的HN和F基因
2.4 PCR扩增VCT/HN、VCT-HN、F/VCT和FACT基因
2.5 重组真核表达质粒的构建
2.6 重组膜蛋白真核表达质粒鉴定
2.7 重组膜蛋白真核表达质粒表达鉴定
2.8 NDV假型病毒的包装及收获
2.9 NDV假型病毒中HN和F蛋白的鉴定
2.10 NDV假型病毒感染293T细胞与Luc荧光活性检测
2.11 HIV-1 P24抗原定量假型病毒
2.12 NDV病毒和NDV假型病毒TCID50测定
2.13 建立NDV假型病毒中和试验
2.14 NDV假型病毒中和试验与传统中和试验的比较
3 结果与分析
3.1 HN和F基因的克隆
3.2 VCT/HN、VCT-HN、F/VCT和FACT基因片段的的扩增
3.3 重组真核表达质粒的构建和鉴定
3.4 重组真核表达质粒的表达鉴定
3.5 NDV假型病毒粒子中HN和F蛋白的ELISA检测
3.6 NDV假型病毒感染293T细胞后的Luciferase活性检测
3.7 影响NDV假型化HIV-Luc假型病毒感染效率的因素
3.8 NDV假型病毒中和试验的建立
3.9 NDV假型化HIV-Luc假型病毒中和试验的验证
4 讨论
第二章 抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体的原核表达及其功能鉴定
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
1.2 杂交瘤细胞总RNA的提取和反转录
1.3 抗体全长基因的扩增及其可变区分析
1.4 VL和VH的PCR扩增
1.5 HN-scFv原核重组表达质粒的构建
1.6 重组蛋白的诱导表达及鉴定
1.7 包涵体复性和纯化
1.8 复性蛋白活性检测
2 结果
2.1 全长抗HN McAb轻链和重链基因的克隆
2.2 抗体可变区VL和VH分析
2.3 HN-scFv原核表达质粒的构建和鉴定
2.4 HN-scFv的诱导表达及复性、纯化
2.5 HN-scFv的功能检测
3 讨论
第三篇 全文结论
参考文献
致谢
本文编号：3797296
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