嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒衣壳蛋白表达与免疫原性研究

发布时间：2023-04-22 11:47

　　猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起猪繁殖障碍等多种疫病的一种重要病原。PCV2为无囊膜的单股环状DNA病毒，基因组全长约为1767bp，病毒的衣壳蛋白只含有一种衣壳蛋白ORF2，60分子的ORF2蛋白可自主组装产生二十面体对称的病毒衣壳结构。已有报道可利用昆虫细胞与大肠杆菌表达组装产生结构相似的PCV2空衣壳样粒子。本研究旨在以PCV2ORF2衣壳蛋白为骨架，嵌合表达口蹄疫病毒(FMDV)的主要中和表位，测定嵌合表位蛋白的免疫原性，为以PCV2衣壳蛋白为骨架嵌合展示异源表位、研究表位展示疫苗奠定基础。 PCV2ORF2蛋白N-端前41个氨基酸为核定位序列(NLS)，为衣壳组装的非必需区；PCV2ORF2衣壳蛋白单体由8个β-折叠片层与之间的loop环结构组成，连接BC、DE、FG与HI的loop环长度为4⁹aa，连接CD、EF与GH环长度为21³6aa，长loop环对稳定衣壳结构有重要作用。 根据上述研究背景，本研究构建了5种改造的PCV2衣壳蛋白，分别为N端NLS序列置换为FMDV中和性抗原表位(O/Mya/98FMDV VP1...

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 猪圆环病毒
        1.1.1 PCV2 自然感染的致病机制
        1.1.2 圆环病毒基因组特征及研究进展
            1.1.2.1 ORF1 基因的研究
            1.1.2.2 ORF2 基因的研究
            1.1.2.3 ORF3 基因的研究
        1.1.3 圆环病毒衣壳结构研究进展
            1.1.3.1 PCV2 衣壳蛋白的装配方式
            1.1.3.2 PCV2 衣壳结构解析的重要性
            1.1.3.3 PCV2 衣壳蛋白的基本构造特征
            1.1.3.4 PCV2 衣壳蛋白表面的抗原位点
            1.1.3.5 PCV2 基于结构的侵染机制
    1.2 口蹄疫病毒
        1.2.1 FMDV 的持续性感染
        1.2.2 FMDV P1 区与衣壳蛋白
        1.2.3 FMDV 抗原表位
        1.2.4 G-H 环合成肽仿制品
            1.2.4.1 载体蛋白和病毒嵌合体
            1.2.4.2 环合肽
            1.2.4.3 逆向-倒转肽类似物
第二章 N 端嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒衣壳蛋白表达与免疫原性研究
    2.1 重组蛋白 PCV2 ORF2-VP1 和原衣壳蛋白 PCV2 ORF2 结构预测分析
        2.1.1 方法
        2.1.2 结果
        2.1.3 讨论
    2.2 重组表达质粒 PET28A-ORF2-VP1(N)，PET28A-ORF2 的构建
        2.2.1 实验材料
            2.2.1.1 病料
            2.2.1.2 表达载体和感受态细胞
            2.2.1.3 酶和试剂
            2.2.1.4 仪器
            2.2.1.5 实验所需溶液
                2.2.1.5.1 培养基
                2.2.1.5.2 琼脂糖凝胶核酸电泳制备
        2.2.2 实验方法
            2.2.2.1 重组表达质粒 pET28a-ORF2 的构建
                2.2.2.1.1 病毒 DNA 的提取
                2.2.2.1.2 PCV2 ORF2 基因 PCR
                2.2.2.1.3 PCV2 ORF2 DNA 纯化
                2.2.2.1.4 pGEM T-ORF2 的构建
                    2.2.2.1.4.1 回收片段 PCV2 ORF2 与克隆载体 pGEM-T 载体的连接
                    2.2.2.1.4.2 连接产物的转化
                    2.2.2.1.4.3 重组质粒 pGEM T-ORF2 质粒的提取
                    2.2.2.1.4.4 重组质粒 pGEM T-ORF2 质粒的酶切鉴定
                2.2.2.1.5 pET28a-ORF2 的构建
            2.2.2.2 N 端嵌合 FMDV 表位重组表达质粒的构建
                2.2.2.2.1 N 端嵌合 FMDV 表位的 PCV2 ORF2 基因的优化合成
                2.2.2.2.2 pET28a-ORF2-VP1 的构建
        2.2.3 实验结果
            2.2.3.1 基因扩增
            2.2.3.2 pET28a-ORF2 的构建
            2.2.3.3 pET28a-ORF2-VP1(N)的构建
        2.2.4 讨论
    2.3 重组蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)与衣壳蛋白 PCV2 ORF2 的原核表达、纯化与复性
        2.3.1 实验材料
            2.3.1.1 感受态细胞
            2.3.1.2 酶和主要试剂
            2.3.1.3 仪器
            2.3.1.4 实验所需溶液
                2.3.1.4.1 培养基
                2.3.1.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所用溶液
        2.3.2 实验方法
            2.3.2.1 重组质粒 pET28a-ORF2-VP1(N)，pET28a-ORF2 的诱导表达
            2.3.2.2 表达产物的可溶性分析
            2.3.2.3 包涵体裂解
            2.3.2.4 蛋白质纯化
            2.3.2.5 蛋白质复性
            2.3.2.6 复性蛋白活性检测
        2.3.3 实验结果
            2.3.3.1 重组蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)与衣壳蛋白 PCV2 ORF2 的表达形式鉴定
            2.3.3.2 重组蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)与衣壳蛋白 PCV2 ORF2 纯化结果分析
            2.3.3.3 重组蛋白 PCV2 ORF2-VP1(N)与衣壳蛋白 PCV2 ORF2 复性后免疫反应性检测
        2.3.4 讨论
    2.4 重组蛋白 ORF2-VP1(N)与衣壳蛋白 ORF2 的免疫原性测定
        2.4.1 实验材料
            2.4.1.1 实验动物
            2.4.1.2 试剂
            2.4.1.3 仪器
        2.4.2 实验方法
            2.4.2.1 抗原制备
            2.4.2.2 实验分组
            2.4.2.3 小鼠脾淋巴细胞的制备
            2.4.2.4 细胞因子测定
            2.4.2.5 免疫小鼠血清 FMDV 抗体检测
                2.4.2.5.1 FMDV 特异性抗体水平检测
                2.4.2.5.2 FMDV 中和抗体滴度测定
            2.4.2.6 免疫小鼠血清 PCV2 抗体检测
        2.4.3 实验结果
            2.4.3.1 重组蛋白免疫小鼠细胞因子水平测定
            2.4.3.2 重组蛋白免疫小鼠 FMDV 抗体水平检测
            2.4.3.3 重组蛋白免疫小鼠 PCV2 抗体水平检测
        2.4.4 讨论
第三章 LOOP 环替换口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒衣壳蛋白表达与免疫原性研究
    3.1 重组蛋白 ORF2-VP1 (CD), ORF2-VP1 (EF), ORF2-VP1 (GH), ORF2-VP1 (ALL)结构预测分析
        3.1.1 方法
        3.1.2 结果
        3.1.3 讨论
    3.2 重组表达质粒 PET28A-ORF2-VP1 (CD), PET28A-ORF2-VP1 (EF), PET28A-ORF2-V P1 (GH), PET28A-ORF2-VP1 (ALL)的构建
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.1 Loop 环替换 FMDV 表位基因的优化合成
            3.2.2.2 重组表达质粒 pET28a-ORF2-VP1 (CD), pET28a-ORF2-VP1 (EF), pET28a -ORF2-VP1 (GH), pET28a-ORF2-VP1 (All)的构建
        3.2.3 实验结果
        3.2.4 讨论
    3.3 重组蛋白 ORF2-VP1 (CD), ORF2-VP1 (EF), ORF2-VP1 (GH), ORF2-VP1 (ALL)的 原核表达、纯化与复性
        3.3.1 实验材料
        3.3.2 实验方法
        3.3.3 实验结果
            3.3.3.1 重组蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(All)的表达形式鉴定
            3.3.3.2 重组蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(All)纯化结果分析
            3.3.3.3 重组蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(All)复性后免疫反应性检测
        3.3.4 讨论
    3.4 重组蛋白 ORF2-VP1(CD), ORF2-VP1(EF), ORF2-VP1(GH), ORF2-VP1(ALL)的免疫原性测定
        3.4.1 实验材料
        3.4.2 实验方法
            3.4.2.1 抗原制备
            3.4.2.2 实验分组
            3.4.2.3 小鼠脾淋巴细胞的制备
            3.4.2.4 细胞因子测定
            3.4.2.5 免疫小鼠血清 FMDV 中和抗体滴度测定
            3.4.2.6 免疫小鼠血清 PCV2 抗体检测
        3.4.3 实验结果
            3.4.3.1 重组蛋白免疫小鼠细胞因子水平测定
            3.4.3.2 重组蛋白免疫小鼠 FMDV LPB-ELISA 抗体水平检测
            3.4.3.3 重组蛋白免疫小鼠 PCV2 抗体水平检测
        3.4.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3797579