传染性胃肠炎病毒多表位抗原在枯草芽孢杆菌表达的研究
发布时间：2023-04-22 13:30
本研究通过对TGEV已知表位的分析,选择具有针对性免疫保护的T细胞表位和B细胞表位,以linker将各表连接起来,构建TGEV多表位抗原的重组菌(pBMB-SN/WB600, pMA5-pSN/WB600)对其进行免疫评价。为更好的防治TGE提供一种理论依据。主要的研究内容如下：1.多表位抗原基因选择和设计合成通过对TGEV已知表位分析,选择了TGEVS蛋白中的A、D抗原表位,N蛋白中的N321抗原表位,根据枯草芽孢杆菌表达系统对密码子的偏爱性,对选择的各表位基因密码子进行优化,各表位之间通过Linker((GGGGS)3)相连,人工合成多表位抗原基因序列SN(D-N321-A)。2.两种不同表达方式重组枯草芽孢杆菌的构建为了获得免疫原性较强的重组菌株,对合成的多表位基因SN进行修饰,构建了多拷贝展示表达重组菌和分泌表达重组菌。多拷贝展示表达重组菌的构建：在pET-28a载体上,利用同尾酶(SaiⅠ和XhoⅠ)将SN序列进行双拷贝和三拷贝,然后克隆到pBMB982-304后,电转到枯草芽孢杆菌WB600中,构建了多拷贝展示表达重组枯草芽孢杆菌pBMB-SN/WB600、 pBMB-2S...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表(Abbreviation)
第一章 文献综述
1.1 猪传染性胃肠炎流行性病学
1.2 猪传染性胃肠炎病毒疫苗研究进展
1.2.1 常规疫苗
1.2.2 基因工程疫苗
1.2.3 TGEV基因工程疫苗存在的问题与展望
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展
1.4 两种不同表达方式的应用
1.4.1 细菌细胞表面展示与应用
1.4.2 细菌分泌表达的研究
1.5 免疫佐剂CpG-ODN和YT研究进展
1.5.1 佐剂CpG-ODN
1.5.2 YT佐剂
第二章 目的与意义
第三章 材料和方法
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株
3.1.2 主要试剂与样品
3.1.3 主要的试验器材
3.1.4 主要的培养基及相关试剂的配制
3.1.5 引物
3.2 试验方法
3.2.1 TGEV多表位抗原基因的设计和合成
3.2.2 PCR扩增靶基因
3.2.3 PCR和酶切产物的电泳检测
3.2.4 限制性内切酶反应
3.2.5 PCR产物以及酶切产物回收与纯化
3.2.6 DNA片段与载体的连接
3.2.7 质粒的小量提取
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备
3.2.9 连接产物转化
3.2.10 SDS-PAGE鉴定
3.3 重组枯草芽孢杆菌的构建
3.3.1 电转培养基的配制
3.3.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备
3.3.3 枯草芽孢杆菌的电转化
3.3.4 重组菌株表达载体的构建以及重组菌的鉴定
3.4 重组菌株的生物学特性研究
3.4.1 重组菌株的蛋白表达
3.4.2 重组菌株生长特性的鉴定
3.4.3 重组菌的生化特性鉴定
3.4.4 重组菌株遗传稳定性的鉴定
3.4.5 电镜检验
3.5 ELISA方法的建立
3.5.1 阳性血清和阴性血清的制备
3.5.2 ELISA具体步骤
3.6 重组菌株的小鼠免疫试验
3.6.1 小鼠口服重组菌株试验
3.6.2 免疫小鼠抗体的采集
第四章 结果与分析
4.1 串联多拷贝载体的的构建与鉴定
4.1.1 串联多拷贝载体的构建
4.1.2 重组质粒的PCR和酶切鉴定
4.2 菌体表面展示表达载体的构建
4.2.1 重组菌株的表达
4.2.2 重组菌株的间接免疫荧光试验
4.3 分泌表达重组菌的构建与表达
4.3.1 分泌表达重组菌构建
4.3.2 重组菌的表达
4.4 重组菌株的遗传稳定性
4.5 重组菌株的生长特性鉴定
4.6 重组菌株的生化特性
4.7 重组菌株和亲本菌形态学观察
4.8 免疫小鼠的免疫原性测定
4.8.1 分泌表达重组菌株的蛋白分析
4.8.2 小鼠口服重组菌后血清中特异性抗体的检测
4.8.3 小鼠口服重组菌后肠黏膜中特异性抗体的检测
4.8.4 小鼠粪便中特异性抗体检测
第五章 讨论
5.1 TGEV基因工程口服疫苗的必要性
5.2 多表位抗原基因SN的设计与合成
5.3 枯草芽孢杆菌表达系统
5.4 重组菌对小鼠的免疫实验
5.5 佐剂CPG-OND和YT对口服动物免疫的影响
第六章 结语
6.1 结论
6.2 创新与存在的问题
6.2.1 创新点
6.2.2 存在的问题
参考文献
致谢
本文编号：3797734
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表(Abbreviation)
第一章 文献综述
1.1 猪传染性胃肠炎流行性病学
1.2 猪传染性胃肠炎病毒疫苗研究进展
1.2.1 常规疫苗
1.2.2 基因工程疫苗
1.2.3 TGEV基因工程疫苗存在的问题与展望
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展
1.4 两种不同表达方式的应用
1.4.1 细菌细胞表面展示与应用
1.4.2 细菌分泌表达的研究
1.5 免疫佐剂CpG-ODN和YT研究进展
1.5.1 佐剂CpG-ODN
1.5.2 YT佐剂
第二章 目的与意义
第三章 材料和方法
3.1 材料
3.1.1 质粒、菌株
3.1.2 主要试剂与样品
3.1.3 主要的试验器材
3.1.4 主要的培养基及相关试剂的配制
3.1.5 引物
3.2 试验方法
3.2.1 TGEV多表位抗原基因的设计和合成
3.2.2 PCR扩增靶基因
3.2.3 PCR和酶切产物的电泳检测
3.2.4 限制性内切酶反应
3.2.5 PCR产物以及酶切产物回收与纯化
3.2.6 DNA片段与载体的连接
3.2.7 质粒的小量提取
3.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备
3.2.9 连接产物转化
3.2.10 SDS-PAGE鉴定
3.3 重组枯草芽孢杆菌的构建
3.3.1 电转培养基的配制
3.3.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备
3.3.3 枯草芽孢杆菌的电转化
3.3.4 重组菌株表达载体的构建以及重组菌的鉴定
3.4 重组菌株的生物学特性研究
3.4.1 重组菌株的蛋白表达
3.4.2 重组菌株生长特性的鉴定
3.4.3 重组菌的生化特性鉴定
3.4.4 重组菌株遗传稳定性的鉴定
3.4.5 电镜检验
3.5 ELISA方法的建立
3.5.1 阳性血清和阴性血清的制备
3.5.2 ELISA具体步骤
3.6 重组菌株的小鼠免疫试验
3.6.1 小鼠口服重组菌株试验
3.6.2 免疫小鼠抗体的采集
第四章 结果与分析
4.1 串联多拷贝载体的的构建与鉴定
4.1.1 串联多拷贝载体的构建
4.1.2 重组质粒的PCR和酶切鉴定
4.2 菌体表面展示表达载体的构建
4.2.1 重组菌株的表达
4.2.2 重组菌株的间接免疫荧光试验
4.3 分泌表达重组菌的构建与表达
4.3.1 分泌表达重组菌构建
4.3.2 重组菌的表达
4.4 重组菌株的遗传稳定性
4.5 重组菌株的生长特性鉴定
4.6 重组菌株的生化特性
4.7 重组菌株和亲本菌形态学观察
4.8 免疫小鼠的免疫原性测定
4.8.1 分泌表达重组菌株的蛋白分析
4.8.2 小鼠口服重组菌后血清中特异性抗体的检测
4.8.3 小鼠口服重组菌后肠黏膜中特异性抗体的检测
4.8.4 小鼠粪便中特异性抗体检测
第五章 讨论
5.1 TGEV基因工程口服疫苗的必要性
5.2 多表位抗原基因SN的设计与合成
5.3 枯草芽孢杆菌表达系统
5.4 重组菌对小鼠的免疫实验
5.5 佐剂CPG-OND和YT对口服动物免疫的影响
第六章 结语
6.1 结论
6.2 创新与存在的问题
6.2.1 创新点
6.2.2 存在的问题
参考文献
致谢
本文编号：3797734
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