稳定表达犬瘟热病毒Nectin4受体的Vero细胞系构建

发布时间：2023-04-22 14:50

　　为提高病毒的分离效率,本试验设计构建了能够表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)上皮细胞Nectin4受体的Vero细胞。为增加蛋白定位的准确性并易于鉴定,使用Igκ信号肽替换原有信号肽序列并添加了HA标签,在Nectin4 ORF后串联IRES-Puro序列并连入pCI-Neo真核表达载体,得到完整的转染载体pCI-N4。不同浓度嘌呤霉素孵育Vero细胞得到最小筛选浓度为6μg/mL。pCI-N4重组质粒转染Vero细胞后使用6μg/mL嘌呤霉素筛选,5～7 d后出现具有抗性的细胞簇,有限稀释法连续单克隆纯化3代后获得稳定表达的细胞系。构建细胞系传代至15代能检测到Nectin4 mRNA转录,Western blotting检测筛选细胞得到约60 ku目的蛋白表达,间接免疫荧光检测显示纯化细胞蛋白表达丰度高且表达均一,激光共聚焦观察Nectin4目的蛋白定位于细胞膜,说明筛选的Vero-Nectin4细胞系能够稳定表达,表达蛋白能够满足作为CDV受体的结构要求。临床CDV阳性病料经研磨滤菌处理后接种构建细胞系能够产生典型的合胞体细胞病变,Vero对照...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 主要试剂
    1.3 引物及表达载体构建
    1.4 Vero细胞稳定细胞系筛选
        1.4.1 Vero细胞嘌呤霉素敏感度测定
        1.4.2 Vero细胞转染及阳性单克隆细胞筛选
        1.4.3 单克隆细胞系鉴定
        1.4.4 Western blotting鉴定目的蛋白表达
        1.4.5 间接免疫荧光方法测定Nectin4受体蛋白的表达
    1.5 CDV分离与鉴定
2 结 果
    2.1 表达载体构建
    2.2 Vero细胞稳定细胞系筛选
    2.3 筛选细胞CDV分离鉴定
3 讨 论
4 结 论



本文编号：3797853