PEDV感染Vero E6细胞mRNA/miRNA表达谱分析及Abl2影响病毒复制机制研究

发布时间：2023-04-24 21:25

　　猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)属于α冠状病毒,可引起仔猪产生急性的、高度接触性肠道传染病。PEDV的感染会导致宿主细胞mRNA与miRNA表达水平动态的变化,并与病毒形成复杂的作用网络。全面的分析差异表达宿主因子对PEDV复制的调控,有助于完整地掌握病毒感染后细胞组分、生物学功能、信号通路的变化规律,了解PEDV的致病机制,筛选影响病毒入侵、调控病毒复制的宿主因子。Vero E6细胞是PEDV分离、传代和进行实验研究的主要细胞。本研究通过对感染PEDV弱毒株CV777与强毒株LNct2的Vero E6细胞进行RNA高通量测序,分析细胞内mRNA及miRNA的差异表达情况。与对照组相比,CV777感染组筛选出33个差异表达基因,LNct2感染组筛选出1854个差异表达基因,两组共有的差异基因为16个。miRNA测序结果显示CV777感染组共产生23个差异表达miRNA,LNct2感染组共产生70个差异表达miRNA,两组共有的差异表达miRNA为10个。对差异表达的宿主因子进行生物信息学分析,结果显示差异表达因子主要富集在调控细胞内信号...

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 猪流行性腹泻病原学概述
        1.1.1 PEDV结构与生物学特性
        1.1.2 PEDV在中国的流行情况
        1.1.3 PEDV的防控与治疗
    1.2 PEDV入侵宿主细胞机制进展
    1.3 冠状病毒mRNA翻译机制
        1.3.1 冠状病毒mRNA翻译具有Cap结构依赖性
        1.3.2 冠状病毒IRES介导的翻译
        1.3.3 宿主与病毒蛋白调节冠状病毒mRNA的翻译
    1.4 转录组学概述
    1.5 miRNA研究进展
        1.5.1 miRNA生物学概述
        1.5.2 miRNA的生物合成
        1.5.3 miRNA介导的mRNA降解机制
        1.5.4 miRNA与病毒感染
    1.6 本研究的目的意义
第二章 PEDV感染Vero E6 细胞mRNA/miRNA表达谱分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 主要实验试剂
        2.1.2 毒株、细胞和抗体
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 构建PEDV感染mRNA/miRNA表达谱测序细胞的筛选
            2.2.1.1 间接免疫荧光实验
            2.2.1.2 半数感染量的测定(TCID₅₀)
            2.2.1.3 荧光定量PCR检测病毒载量
        2.2.2 PEDV感染细胞mRNA/miRNA高通量测序
        2.2.3 转录组测序结果分析
            2.2.3.1 测序质量分析与表达差异分析
            2.2.3.2 差异表达基因功能富集分析
        2.2.4 转录组测序结果验证
            2.2.4.1 RT-qPCR验证差异表达mRNA变化
            2.2.4.2 RT-qPCR验证干扰素刺激基因差异表达
            2.2.4.3 Western blot验证MAPK通路变化
        2.2.5 miRNA表达差异分析
        2.2.6 miRNA高通量测序结果验证
            2.2.6.1 miRNA提取与反转录
            2.2.6.2 miRNA RT-qPCR验证
    2.3 结果
        2.3.1 PEDV感染靶细胞的筛选
            2.3.1.1 间接免疫荧光实验
            2.3.1.2 TCID₅₀的测定
            2.3.1.3 荧光定量PCR检测病毒载量
        2.3.2 转录组测序结果分析
            2.3.2.1 转录组测序结果整理与质量分析
            2.3.2.2 差异表达mRNA分析
            2.3.2.3 差异表达基因功能GO富集分析
            2.3.2.4 KEGG细胞通路富集分析
        2.3.3 PEDV感染差异表达mRNA验证
            2.3.3.1 RT-qPCR验证主要差异表达mRNA
            2.3.3.2 RT-qPCR验证差异表达ISGs
            2.3.3.3 PEDV感染激活MAPK信号通路
        2.3.4 PEDV感染Vero E6 细胞miRNA表达规律
            2.3.4.1 原始数据统计及过滤
            2.3.4.2 差异表达miRNA分析
            2.3.4.3 差异表达miRNA候选靶基因GO富集分析
            2.3.4.4 差异表达miRNA候选靶基因KEGG富集分析
        2.3.5 加poly(A)尾法RT-qPCR验证miRNA测序结果
    2.4 讨论
        2.4.1 PEDV感染后差异mRNA表达规律分析
        2.4.2 miRNA与 mRNA表达谱联合分析
第三章 Abl2 影响PEDV复制机制研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 细胞、质粒和病毒
        3.1.2 抗体、试剂盒、抑制剂
        3.1.3 敲低Abl2对PEDV复制的影响
            3.1.3.1 RNAi干扰实验
            3.1.3.2 抑制剂实验
        3.1.4 抑制剂加入时间对PEDV复制的影响
        3.1.5 IFA检测PEDV介导的细胞融合
        3.1.6 Abl2对其他猪肠道冠状病毒感染的影响
    3.2 结果
        3.2.1 siRNA下调Abl2 表达抑制PEDV的增殖
        3.2.2 Abl2 抑制剂可显著抑制PEDV复制
        3.2.3 Abl2 不影响PEDV吸附过程
        3.2.4 Abl2 影响PEDV复制早期阶段
        3.2.5 Imatinb在病毒入侵阶段抑制PEDV复制
        3.2.6 Abl2 抑制剂抑制PEDV诱导的合胞体的形成
        3.2.7 Abl2对猪肠道冠状病毒复制的影响
    3.3 讨论
第四章 影响PEDV复制miRNA的筛选及其靶基因的验证
    4.1 材料和方法
        4.1.1 细胞、毒株和载体
        4.1.2 主要试剂与仪器
        4.1.3 影响PEDV复制差异表达miRNA筛选
        4.1.4 miR-486-5p靶基因的预测
        4.1.5 miR-486-5p靶基因的验证
            4.1.5.1 双荧光素酶报告系统检测miR-486-5p与靶基因3’UTR结合
            4.1.5.2 RNAi干扰靶基因对PEDV复制的影响
        4.1.6 RT-qPCR检测PEDV感染后SRSF3 mRNA表达水平变化
        4.1.7 敲低SRSF3对PEDV复制的影响
        4.1.8 过表达SRSF3对PEDV复制的影响
            4.1.8.1 SRSF3真核表达载体的构建
            4.1.8.2 SRSF3 转染Vero E6 细胞
            4.1.8.3 PEDV感染过表达SRSF3 Vero E6 细胞
        4.1.9 激光共聚焦实验
        4.1.10 免疫共沉淀实验
    4.2 结果
        4.2.1 影响PEDV复制的差异表达miRNA初步筛选
        4.2.2 miR-486-5p抑制PEDV复制
        4.2.3 miR-486-5p与靶基因互作网络图的构建
        4.2.4 miR-486-5p靶基因的验证
            4.2.4.1 RT-qPCR验证miR-486-5p的靶基因
            4.2.4.2 双荧光素酶报告系统验证miR-486-5p的靶基因
            4.2.4.3 敲低miR-486-5p候选靶基因对PEDV复制的影响
        4.2.5 SRSF3在PEDV感染过程中显著上调
        4.2.6 敲低SRSF3抑制PEDV的复制
        4.2.7 过表达SRSF3促进PEDV的复制
        4.2.8 SRSF3与PEDV N蛋白不发生相互作用
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3800042