鸡NK细胞的分离鉴定及靶细胞筛选
发布时间：2023-04-25 20:29
自然杀伤(Natural killer, NK)细胞是一类重要的淋巴细胞,在抗病毒和疾病的遗传抗性中具有重要作用。然而,至今,对NK细胞的认识大多来源于小鼠和人类,并不清楚这些认识是否适用于其他动物。鸡是非哺乳动物中禽类的代表动物,至今对鸡NK细胞了解不多。已有的证据表明,鸡NK细胞与哺乳动物NK细胞差异巨大。由于缺乏特异性抗体,14日龄鸡胚脾脏是鸡NK细胞的主要来源,并主要根据形态学和功能学进行鉴定。鸡NK细胞在多种疾病中具有重要作用,而BNK等C型凝结素基因在鸡主要相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)和NK细胞中的发现暗示鸡NK细胞可能在疾病的遗传抗性中扮演重要角色。 本研究利用实验室建立的SPF B19和B21MHC单倍型鸡,收集14日龄鸡胚新鲜脾脏,并用冷胰酶消化法分离收获淋巴细胞,并在添加条件培养基和鸡重组IL-2的完全培养基中培养48h后,收获悬浮细胞,既为鸡NK细胞。流式前向角和侧向角分析显示培养的细胞中85.1%的细胞大小均一,颗粒度一致；瑞氏吉姆萨染料染色结果表明收获的细胞内一侧含有嗜酸性大颗粒,符合鸡NK细胞的形...
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
1.1 研究的目的和意义
1.2 NK细胞研究现状
1.2.1 NK细胞的概述
1.2.2 NK细胞的表面标记
1.2.3 NK细胞受体
1.2.4 NK细胞的识别
1.3 鸡NK细胞
1.3.1 鸡NK细胞的发现
1.3.2 鸡NK细胞与抗病毒感染
1.3.3 鸡NK细胞的受体
第二章 鸡NK细胞的分离培养及表型鉴定
2.1 材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 鸡胚脾脏淋巴细胞的分离和培养
2.2.2 鸡NK细胞的鉴定
2.3 结果
2.3.1 细胞的形态学鉴定
2.3.2 细胞免疫表型鉴定
2.4 讨论
第三章 鸡NK细胞靶细胞的筛选及其杀伤机制分析
3.1 材料
3.1.1 动物及细胞
3.1.2 主要试剂
3.2 方法
3.2.1 效应细胞的制备
3.2.2 CFSE工作浓度的优化及标记靶细胞
3.2.3 Triton 100的工作浓度的优化
3.2.4 鸡NK细胞靶细胞的筛选
3.2.5 B21鸡NK细胞与B19鸡细胞体外杀伤活性的比较
3.2.6 鸡NK细胞对YAC-1杀伤机制的分析
3.3 结果
3.3.1 CFSE工作浓度的优化
3.3.2 Triton 100的工作浓度的测定
3.3.3 鸡NK细胞的细胞杀伤功能
3.3.4 MHC—B单倍型鸡NK细胞的细胞杀伤活性比较
3.3.5 鸡NK细胞的细胞杀伤机制
3.4 讨论
3.4.1 利用流式细胞术检测NK细胞杀伤活性
3.4.2 鸡NK细胞跨物种杀伤小鼠源靶细胞YAC-1细胞不杀伤人源K562细胞
3.4.3 B21单倍型鸡NK细胞细胞杀伤活性强于B19
3.4.4 鸡NK细胞对YAC-1细胞系的杀伤与YAC-1细胞表面MHC Ⅰ类分子和活化性配体H60和RAE-1无关
第四章 B19和B21鸡NK细胞受体BNK的表达及兔多抗制备
4.1 材料
4.1.1 菌株、质粒和实验动物
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要设备
4.1.4 引物设计与合成
4.2 方法
4.2.1 BNK19和BNK21基因的RT-PCR扩增
4.2.2 原核表达重组质粒的构建
4.2.3 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳
4.2.4 重组蛋白对His单抗的Western blot检测
4.2.5 BNK重组蛋白兔多克隆抗体的制备
4.2.6 多抗特异性的Western blot检测
4.3 结果
4.3.1 BNK19和BNK21基因片段分析和PCR扩增结果
4.3.2 BNK19和BNK21重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
4.3.3 重组蛋白对标签His单抗的Western b1ot检测
4.3.4 兔多克隆抗体的制备
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3801008
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
1.1 研究的目的和意义
1.2 NK细胞研究现状
1.2.1 NK细胞的概述
1.2.2 NK细胞的表面标记
1.2.3 NK细胞受体
1.2.4 NK细胞的识别
1.3 鸡NK细胞
1.3.1 鸡NK细胞的发现
1.3.2 鸡NK细胞与抗病毒感染
1.3.3 鸡NK细胞的受体
第二章 鸡NK细胞的分离培养及表型鉴定
2.1 材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 鸡胚脾脏淋巴细胞的分离和培养
2.2.2 鸡NK细胞的鉴定
2.3 结果
2.3.1 细胞的形态学鉴定
2.3.2 细胞免疫表型鉴定
2.4 讨论
第三章 鸡NK细胞靶细胞的筛选及其杀伤机制分析
3.1 材料
3.1.1 动物及细胞
3.1.2 主要试剂
3.2 方法
3.2.1 效应细胞的制备
3.2.2 CFSE工作浓度的优化及标记靶细胞
3.2.3 Triton 100的工作浓度的优化
3.2.4 鸡NK细胞靶细胞的筛选
3.2.5 B21鸡NK细胞与B19鸡细胞体外杀伤活性的比较
3.2.6 鸡NK细胞对YAC-1杀伤机制的分析
3.3 结果
3.3.1 CFSE工作浓度的优化
3.3.2 Triton 100的工作浓度的测定
3.3.3 鸡NK细胞的细胞杀伤功能
3.3.4 MHC—B单倍型鸡NK细胞的细胞杀伤活性比较
3.3.5 鸡NK细胞的细胞杀伤机制
3.4 讨论
3.4.1 利用流式细胞术检测NK细胞杀伤活性
3.4.2 鸡NK细胞跨物种杀伤小鼠源靶细胞YAC-1细胞不杀伤人源K562细胞
3.4.3 B21单倍型鸡NK细胞细胞杀伤活性强于B19
3.4.4 鸡NK细胞对YAC-1细胞系的杀伤与YAC-1细胞表面MHC Ⅰ类分子和活化性配体H60和RAE-1无关
第四章 B19和B21鸡NK细胞受体BNK的表达及兔多抗制备
4.1 材料
4.1.1 菌株、质粒和实验动物
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要设备
4.1.4 引物设计与合成
4.2 方法
4.2.1 BNK19和BNK21基因的RT-PCR扩增
4.2.2 原核表达重组质粒的构建
4.2.3 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳
4.2.4 重组蛋白对His单抗的Western blot检测
4.2.5 BNK重组蛋白兔多克隆抗体的制备
4.2.6 多抗特异性的Western blot检测
4.3 结果
4.3.1 BNK19和BNK21基因片段分析和PCR扩增结果
4.3.2 BNK19和BNK21重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
4.3.3 重组蛋白对标签His单抗的Western b1ot检测
4.3.4 兔多克隆抗体的制备
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3801008
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