抗流感基因的筛选与功能验证和HSP27负调控干扰素通路研究

发布时间：2023-05-07 15:34

　　猪是流感病毒发生重配的“混合器”以及产生流感病毒新毒株的“孵育器”,因而猪在流感病毒种间传播中扮演重要角色,因此防止流感病毒在猪群中的传播具有很重要的公共卫生意义。天然免疫系统是机体抵御外界病原感染的非特异性防御系统,宿主是否发病取决于病原感染和机体防御相互作用的结果,防御能力较强的猪便表现出天然的抗病力。因此,从遗传本质上提高猪对猪流感等病毒的抗病能力,筛选和培育具有抗流感病毒的动物品系,是防控流感病毒的治本之策。而获得有效的抗病候选基因是开展抗病育种工作的重中之重。同时,流感病毒为了有效的感染宿主会采取各种策略拮抗宿主的抗病毒防御应答,尤其是干扰素介导的天然免疫应答。热休克蛋白27(HSP27)是一种细胞内广泛表达的小热休克蛋白。病毒感染宿主细胞几乎都会诱导HSP27的高度表达,但是其在病毒感染中的作用仍不清楚。同时,有研究表明,HSP27能够参与调节细胞信号转导通路,包括NF-κB介导的炎症应答通路,但其在宿主干扰素信号通路中的功能尚不清楚。因此,本研究首先以猪转录组芯片-生物信息学为平台初步筛选流感病毒感染猪诱导表达的基因,通过过表达和沉默技术检测这些基因对流感病毒增殖的影响,...

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
    1 猪流感
        1.1 北美猪流感病毒
        1.2 欧亚猪流感病毒
        1.3 甲型H1N1猪流感病毒
        1.4 猪与禽流感病毒
    2 高通量筛选病毒感染相关宿主基因技术
        2.1 蛋白互作技术
        2.2 基因组学
        2.3 蛋白质组学
        2.4 RNAi
    3 天然免疫系统
        3.1 模式识别受体
        3.2 TLRs
        3.3 RLRs
        3.4 干扰素
        3.5 JAK-STAT通路
        3.6 干扰素诱导基因
    4 流感病毒诱导的信号通路
    5 干扰素负调控机制
        5.1 降解主要的接头分子
        5.2 对接头分子进行蛋白修饰
        5.3 阻断接头分子的互作
        5.4 流感病毒拮抗干扰素通路的策略
            5.4.1 通过病毒蛋白拮抗干扰素
            5.4.2 通过宿主蛋白拮抗干扰素
    6 热休克蛋白
        6.1 HSP60
        6.2 HSP70
        6.3 HSP90
        6.4 sHSPs
    7 HSP27功能介绍
        7.1 HSP27抗凋亡功能
        7.2 HSP27与免疫应答
        7.3 HSP27与病毒感染
第2章 目的与意义
第3章 材料与方法
    1 材料
        1.1 细菌、细胞和病毒
        1.2 质粒
            1.2.1 真核表达质粒
            1.2.2 启动子相关质粒
            1.2.3 克隆质粒
            1.2.4 RNAi质粒
            1.2.5 细胞定位质粒
            1.2.6 泛素化相关质粒
        1.3 抗体
        1.4 siRNA
        1.5 主要试剂
        1.6 重要仪器和设备
    2 主要方法
        2.1 DNA实验
            2.1.1 基因克隆
            2.1.2 DNA回收和质粒抽提
            2.1.3 基因组DNA提取
            2.1.4 基因突变技术
        2.2 RNA实验
            2.2.1 TRIzol法抽提细胞总RNA
            2.2.2 RT-PCR
            2.2.3 荧光定量PCR
        2.3 蛋白实验
            2.3.1 细胞蛋白抽提及浓度测定
            2.3.2 荧光素酶活性检测实验
            2.3.3 免疫共沉淀实验步骤
            2.3.4 蛋白的泛素化检测实验
            2.3.5 SDS-PAGE电泳
            2.3.6 蛋白质转膜
            2.3.7 Western Blot实验
            2.3.8 GTP酶活性测定实验
            2.3.9 流感病毒聚合酶活性测定实验
        2.4 细胞实验
            2.4.1 质粒转染实验
            2.4.2 siRNA转染实验
            2.4.3 间接免疫荧光
            2.4.4 蛋白亚细胞定位观察
            2.4.5 TCID50的测定
            2.4.6 空斑法检测病毒含量
        2.5 肺组织病理切片制作
        2.6 统计学处理
第4章 结果与讨论
    1 抗流感病毒基因的筛选与功能验证
        1.1 猪H1N1流感病毒感染模型建立
            1.1.1 临床症状
            1.1.2 病理变化
        1.2 猪H1N1流感病毒感染肺组织芯片
            1.2.1 肺组织RNA样品检测
            1.2.2 芯片分析
                1.2.2.1 聚类分析
                1.2.2.2 GO分析
                1.2.2.3 主要的差异表达基因
                1.2.2.4 差异基因Pathway分析
            1.2.3 芯片结果RT-PCR验证
            1.2.4 RT-PCR检测猪肺组织ISGs表达变化
        1.3 肺组织差异基因抗病毒功能
            1.3.1 干扰素诱导基因对H1N1病毒增殖的影响
            1.3.2 干扰素诱导基因对H5N1病毒增殖的影响
            1.3.3 猪宿主防御肽对H5N1病毒增殖影响
            1.3.4 猪干扰素启动子活性检测
            1.3.5 干扰素诱导基因过表达对干扰素启动子影响
        1.4 IRF1抗病毒机制研究
            1.4.1 IRF1过表达对H5N1病毒复制的影响
            1.4.2 IRF1过表达对VSV复制的影响
            1.4.3 IRF1过表达对干扰素信号通路影响
        1.5 GBP1抗病毒机制研究
            1.5.1 GBP1过表达对流感病毒增殖的影响
                1.5.1.1 GBP1抑制各种亚型猪流感病毒的复制
                1.5.1.2 GBP1对H5N1流感病毒不同形式RNA的影响
            1.5.2 敲除GBP1对流感病毒增殖的影响
            1.5.3 GTP结合位点与抗病毒有关
                1.5.3.1 GBP1抗病毒结构域确定
                1.5.3.2 GTP结合位点突变后对病毒增殖影响
                1.5.3.3 GBP1的GTPase酶活性测定
            1.5.4 GBP1对干扰素信号通路通路的影响
            1.5.5 GBP1抑制流感病毒聚合酶活力
            1.5.6 GBP1与NP蛋白互作
            1.5.7 GBP1与NP在细胞核周围共定位
        1.6 讨论
        1.7 小结
    2 HSP27拮抗宿主干扰素信号通路研究
        2.1 H5N1感染人的A549细胞后总蛋白表达变化
        2.2 H5N1感染人的A549细胞后HSP27蛋白表达变化
        2.3 其他RNA病毒感染细胞后HSP27变化
        2.4 HSP27定点突变与表达
        2.5 HSP27过表达对H5N1增殖影响
        2.6 HSP27过表达对VSV病毒增殖的影响
        2.7 HSP27沉默对VSV增殖的影响
        2.8 HSP27过表达对干扰素等启动子影响
        2.9 HSP27过表达抑制VISA和TRIF介导的抗病毒作用以及IRF3磷酸化
        2.10 HSP27沉默对干扰素等启动子影响
        2.11 HSP27与IFN-β通路接头分子互作
        2.12 HSP27对VISA、TRAF3和TRAF6表达影响
        2.13 HSP27影响接头分子泛素化
        2.14 HSP27通过K48泛素化方式降解TRAF3和TRAF6
        2.15 HSP27不改变TRAF3和TRAF6的K63泛素化
        2.16 HSP27定位于线粒体
        2.17 HSP27磷酸化抑制剂对VSV-GFP病毒增殖影响
        2.18 HSP27磷酸化对干扰素启动子活性以及H5N1病毒CPE影响
        2.19 HSP27磷酸化位点突变体与VISA互作研究
        2.20 讨论
        2.21 小结
第5章 总结
参考文献
个人简历
发表的主要论文
致谢



本文编号：3810844