高效价猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白多克隆抗体的制备及初步应用

发布时间：2023-05-08 02:23

　　猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)被公认为是严重危害全世界养猪业的重要病原,其感染可以引起多种圆环病毒相关疾病(PCV2-associated diseases,PCVD),包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征和母猪繁殖障碍综合征等疾病,导致巨大经济损失。PCV2是一种单链环状DNA病毒,是目前已知的最小的动物病毒之一,其感染的靶细胞主要是巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等多种免疫细胞,因此PCV2感染还可导致动物机体发生严重的免疫抑制。另外,PCV2感染还可促进多种病原的共感染。虽然疫苗免疫可显著降低PCV2相关疾病的发生,但却不能清除PCV2的感染。研究显示PCV2在养猪业中感染率可高达60%以上。然而,目前对于PCV2的感染和致病的详细机制尚不完全清楚。衣壳蛋白(Capsid protein,Cap)是PCV2主要的抗原蛋白,含有病毒的主要抗原决定簇,在病毒的识别和入侵过程中起重要作用。制备抗Cap抗体是研究PCV2致病机制的有利工具之一。但PCV2 ORF2全长在大肠杆菌中表达量低且多为包涵体形式存在,限制了Cap蛋...

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【学位级别】：硕士

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英文摘要
1 前言
    1.1 猪圆环病毒的流行现状与防控
    1.2 PCV2 的分子生物学特征
        1.2.1 猪圆环病毒的结构和特征
        1.2.2 猪圆环病毒主要开放阅读框及其编码蛋白
        1.2.3 猪圆环病毒的复制
    1.3 猪圆环病毒的检测
        1.3.1 病毒分离
        1.3.2 PCR检测方法
        1.3.3 酶联免疫吸附实验检测(ELISA)
        1.3.4 间接免疫荧光法检测(IFA)
        1.3.5 间接免疫组化法检测(IHC)
    1.4 圆环病毒抗体的研究进展
    1.5 本研究目的意义
2 材料与方法
    2.1 主要仪器设备
    2.2 实验材料
    2.3 实验方法
        2.3.1 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列分析与目的基因扩增
        2.3.2 DNA琼脂糖凝胶纯化与回收
        2.3.3 感受态细胞的制备
        2.3.4 重组表达载体构建与鉴定
        2.3.5 重组质粒的小量提取
        2.3.6 重组蛋白的诱导表达
        2.3.7 SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色
        2.3.8 免疫印迹
        2.3.9 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化
        2.3.10 重组蛋白的纯化
        2.3.11 蛋白浓度测定
        2.3.12 纯化蛋白的透析浓缩
        2.3.13 实验动物免疫与血清采集
        2.3.14 酶联免疫吸附实验
        2.3.15 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化血清
        2.3.16 细胞的培养、复苏以及冻存
        2.3.17 PCV2 病毒感染的细胞和动物模型
        2.3.18 细胞间接免疫荧光
        2.3.19 组织切片与免疫组织化学分析
        2.3.20 PCV2 临床毒株的分离与鉴定
3 结果与分析
    3.1 PCV2 Cap蛋白原核表达载体的构建与鉴定
    3.2 Cap蛋白的可溶性诱导表达及条件优化
    3.3 重组蛋白的纯化及检测
    3.4 多克隆抗血清效价的检测
    3.5 抗血清特异性检测
    3.6 抗血清的纯化与特异性检测
    3.7 应用抗Cap多克隆抗体进行间接免疫荧光和免疫组化检测
    3.8 抗Cap多克隆抗体的临床应用
4 讨论
5 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3811792