从江香猪PDK4、FGF10基因的克隆表达与功能研究

发布时间：2023-05-11 00:39

　　PDK4基因是丙酮酸脱氢酶激酶家族的成员,主要在脂肪代谢、糖酵解、三羧酸循环以及ATP形成等生理过程发挥重要作用,有研究表明PDK4基因是影响家禽脂肪沉积的重要候选基因。FGF10基因是成纤维细胞生长因子家族的一员,参与多种器官的发育和成熟过程,研究表明FGF10在白色脂肪组织的发育和代谢过程中具有重要的作用。但有关于PDK4、FGF10基因在从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中是否具有调控作用尚不清楚。本研究以贵州从江香猪为试验对象,采用分子克隆、实时荧光定量PCR、细胞培养、超表达和干扰等方法,阐述了PDK4、FGF10基因组织表达特性和对从江香猪肌内前体脂肪细胞分化的影响。主要研究结果如下:1.成功克隆了从江香猪PDK4、FGF10基因CDS区,生物信息学分析得知从江香猪PDK4基因的编码区全长1224 bp,编码407个氨基酸;FGF10基因的编码区全长636 bp,编码211个氨基酸。经BLAST软件进行同源性比对,发现从江香猪PDK4基因与羊、马、人的核苷酸序列同源性分别为93%、92%、91%;FGF10基因与羊、牛、人、鼠的核苷酸序列同源性分别为94%、93%、93%、9...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 研究背景
        1.1 从江香猪概述
        1.2 丙酮酸脱氢酶激酶家族
        1.3 PDK4基因研究概述
            1.3.1 PDK4基因结构特点
            1.3.2 PDK4基因的生物学功能
            1.3.3 PDK4基因在畜禽中研究现状
        1.4 FGF家族研究概述
        1.5 FGF10基因研究概述
            1.5.1 FGF10基因生物学特性
            1.5.2 FGF10基因的生物学功能及研究现状
        1.6 脂肪细胞分化过程关键调控因子
    2 本研究的目的和意义
第二章 PDK4、FGF10基因的克隆及组织表达分析
    1 试验材料
        1.1 试验动物与样品
        1.2 主要试验试剂
        1.3 试验仪器设备
        1.4 常用试剂的配置
    2 试验方法
        2.1 引物的设计与合成
        2.2 组织总RNA的提取
        2.3 RNA纯度及浓度检测
        2.4 合成cDNA
        2.5 PCR扩增
        2.6 PDK4、FGF10基因序列分析
        2.7 实时荧光定量PCR
        2.8 数据统计分析
    3 结果与分析
        3.1 RNA纯度检测
        3.2 从江香猪PDK4、FGF10基因RT-PCR扩增结果
        3.3 从江香猪PDK4、FGF10基因测序结果分析
        3.4 从江香猪PDK4、FGF10蛋白相关生物信息学分析
        3.5 实时荧光定量PCR结果分析
            3.5.1 基因克隆
            3.5.2 qRT-PCR产物特异性分析
            3.5.3 不同组织中PDK4基因的表达分析
            3.5.4 不同组织中FGF10基因的表达分析
    4 讨论
    5 小结
第三章 PDK4、FGF10基因的过表达载体构建
    1 试验材料
        1.1 试验样品、菌株和载体
        1.2 试验仪器设备
        1.3 试验试剂
        1.4 常用试剂配置
    2 试验方法
        2.1 感受态细胞的制备
        2.2 pUCM-T-PDK4、pUCM-T-FGF10重组质粒的构建
            2.2.1 PDK4、FGF10基因与pUCM-T载体的连接
            2.2.2 连接产物的转化
            2.2.3 重组质粒的菌液PCR鉴定
            2.2.4 重组质粒的提取
            2.2.5 重组质粒的测序鉴定
            2.2.6 菌种的保存
        2.3 pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10重组质粒的构建
            2.3.1 重组质粒胶回收
            2.3.2 目的片段与pEGFP-C1载体的连接
            2.3.3 连接产物的转化
            2.3.4 pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10重组质粒的菌液PCR
    3 结果与分析
        3.1 重组质粒pUCM-T-PDK4、pUCM-T-FGF10的鉴定
        3.2 重组质粒pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10的鉴定
    4 讨论
    5 小结
第四章 PDK4、FGF10基因干扰载体构建
    1 试验材料
        1.1 试验材料及主要试剂
        1.2 试验仪器设备
    2 试验方法
        2.1 PDK4基因干扰载体的构建
            2.1.1 寡核苷酸的设计及合成
            2.1.2 引物退火
            2.1.3 载体与siRNA的连接
            2.1.4 连接产物的转化及鉴定
        2.2 FGF10基因干扰载体的构建
            2.2.1 siRNA的设计及合成
            2.2.2 引物退火
            2.2.3 载体与siRNA的连接
            2.2.4 连接产物的转化及鉴定
    3 结果
        3.1 pLVX-ShRNA2-puro-sPDK4载体酶切鉴定
        3.2 pLVX-ShRNA2-puro-sPDK4载体测序鉴定
        3.3 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-sFGF10测序结果
    4 讨论
    5 小结
第五章 PDK4、FGF10基因对脂质代谢的影响
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 试验仪器设备
        1.3 试验主要试剂与器材
        1.4 主要试剂的配制
    2 试验方法
        2.1 肌内前体脂肪细胞的原代培养
        2.2 细胞的传代培养
        2.3 细胞的诱导分化
        2.4 细胞分化PDK4、FGF10基因的时序表达
        2.5 重组质粒的瞬时转染
            2.5.1 无内毒素质粒的提取
            2.5.2 瞬时转染
        2.6 PDK4、FGF10基因最佳干扰载体的筛选
        2.7 实时荧光定量PCR
    3 结果与分析
        3.1 从江香猪肌内前体脂肪细胞形态观察
        3.2 诱导分化及油红O染色
        3.3 细胞分化PDK4、FGF10基因的时序表达
        3.4 PDK4、FGF10基因最佳干扰载体的筛选
            3.4.1 PDK4基因干扰载体的瞬时转染
            3.4.2 PDK4基因干扰效率的检测
            3.4.3 FGF10基因干扰载体的瞬时转染
            3.4.4 FGF10基因干扰效率的检测
        3.5 pEGFP-C1-PDK4、pEGFP-C1-FGF10的瞬时转染
        3.6 PDK4、FGF10基因上调对脂代谢相关基因表达的影响
        3.7 PDK4、FGF10基因下调对脂代谢相关基因表达的影响
    4 讨论
    5 小结
第六章 结论与展望
    1 结论
    2 展望
参考文献
致谢
附录



本文编号：3813809