Ca 2+ /CaM/CaMKs信号通路在镉影响破骨细胞分化中的作用

发布时间：2023-05-13 12:27

　　随着工业的发展,环境中的镉通过消化道和呼吸道进入生物体内引起镉的慢性蓄积。骨骼是镉毒性作用的重要靶器官,长期低剂量的镉暴露引起骨密度下降,抑制骨矿化。研究表明,镉能增加成骨细胞RANKL的表达,同时抑制骨保护素(OPG)的表达,进而促进破骨细胞(OC)的分化,同时镉也能促进破骨细胞前体RAW264.7细胞向OC分化,但镉调控OC分化的分子机制尚不清楚。钙离子是细胞中重要的生理调节因子,可以调控细胞的增殖、分化和凋亡等。本文以5-6周龄C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞诱导形成OC,研究不同浓度镉处理对OC分化的影响,以及钙离子和CaM/CaMKs信号在镉影响OC分化的作用机制。1.镉对OC分化的影响采集5-6周龄C57BL/6雄性小鼠骨髓巨噬细胞,以0、20、50、100nM的镉加入含有30 ng/ml M-CSF 和 60 ng/ml RANKL 的 α-MEM 培养基,培养 5d 后,TRAP 染色鉴定 OC的形成数量,Western blot检测OC中NFATcl、TRAP、CAII、CK蛋白表达水平,RT-qPCR检测OC相关基因NFATcl、TRAP、c-Fos、CAII的表达...

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
符号说明
第一部分 文献综述
    第一章 镉毒性作用及分子机制的研究进展
        1.镉的毒性损伤机制
        2.镉的毒性作用
        3.镉对骨骼及破骨细胞的毒性作用
    第二章 OC分化的研究进展
        1. M-CSF/c-Fms通路与OCP分化的调控
        2. RANKL/RANK/OPG通路在OC分化中的作用
    第三章 钙离子信号及Ca²⁺/CaM/CaMKs信号通路
        1. 钙离子在细胞中的作用
            1.1 钙离子动员
            1.2 钙离子振荡
            1.3 Ca²⁺/CaM/CaMKs
        2. Ca²⁺/CaM/CaMKs在OC分化中的作用
第二部分 试验研究
    第一章 镉对小鼠OC分化的影响
        1. 材料和方法
            1.1 实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2. 方法
            2.1 骨髓单核细胞的分离及OC的诱导分化
            2.2 骨髓单核细胞活性的测定
            2.3 TRAP染色及计数
            2.4 蛋白样品提取
            2.5 Western blot方法测定相关蛋白
            2.6 RNA样品提取
            2.7 引物设计与合成
            2.8 互补脱氧核苷酸(cDNA)制备
            2.9 基因组DNA消除反应
            2.10 反转录反应
            2.11 RT-qPCR
            2.12 数据分析
        3. 结果
            3.1 RTCA法检测镉对骨髓巨噬细胞活性的影响
            3.2 TRAP染色法观察镉对OC形成的影响
            3.3 RT-qCR检测镉对OC相关标志基因表达的影响
            3.4 Western blot检测镉对OC相关标志蛋白表达的影响
            3.5 讨论
    第二章 钙离子信号在镉影响OC分化过程中的作用
        1. 材料和方法
            1.1 实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2. 方法
            2.1 骨髓单核细胞的分离培养
            2.2 OC的诱导
            2.3 TRAP染色及计数
            2.4 蛋白样品提取
            2.5 Western blot方法
            2.6 激光共聚焦显微镜检测钙离子
            2.7 数据分析
        3. 结果
            3.1 激光共聚焦显微镜检测镉对胞内钙离子浓度的影响
            3.2 激光共聚焦显微镜检测镉和BAPTA-AM对胞内钙离子浓度的影响
            3.3 TRAP染色法观察钙离子在镉对OC分化中的作用
            3.4 Western blot检测细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM在镉影响OC分化过程中的作用
            3.5 Western blot检测内质网钙离子抑制剂TG(Thapsigargin)调控OC分化过程中的作用
            3.6 Western blot检测内质网钙离子抑制剂2-APB对OC分化过程中的影响
        4. 讨论
    第三章 Ca²⁺/CaM/CaMKs信号通路在镉影响OC分化过程中的作用
        1. 材料和方法
            1.1 实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2. 方法
            2.1 骨髓单核细胞的分离培养
            2.2 OC的诱导
            2.3 TRAP染色及计数
            2.4 蛋白样品提取
            2.5 Western blot方法
            2.6 数据分析
        3. 结果
            3.1 TRAP染色观察抑制Ca²⁺/CaM/CaMKs信号通路对镉影响OC分化的作用
            3.2 Western blot检测镉影响OC分化中Ca²⁺/CaM/CaMKs信号通路关键蛋的表达
            3.3 Western blot检测Ca²⁺/CaM/CaMK信号通路在镉影响OC分化中的作用
        4. 讨论
全文结论
参考文献
致谢



本文编号：3815819