腐败梭菌α毒素阻断ELISA抗体检测方法的建立
发布时间：2023-05-14 05:55
腐败梭菌(Clostridium septium)是人的气性坏疽以及猪、马、牛、羊、鸡、鹿等多种动物的恶性水肿病的主要病原,产生的α毒素(Clostridium septicum alpha toxin,CSA)是其分泌的几种外毒素中最主要致死性毒力因子和免疫原,具有溶血活性,能够导致机体细胞坏死。腐败梭菌感染羊引起羊快疫,发病羊病程多呈急性经过,发病后迅速死亡,病死率高,给我国畜牧业带来巨大经济损失。疫苗免疫是防治羊快疫的主要手段,由于缺乏体外抗体检测方法。该类疫苗免疫后效果评价多采用血清-毒素中和后经尾静脉注射小鼠,根据小鼠死亡情况判定血清中和抗体效价的方法,该方法操作繁琐,难以用于临床大量样本的免疫效果评价。为此,本研究拟通过制备腐败梭菌α毒素单克隆抗体,建立腐败梭菌α毒素阻断ELISA检测方法,以期用快速、简便、高通量的体外检测方法替代动物检验法,用于疫苗的效力检验及疫苗免疫后效果评价。本研究采用原核表达系统,通过缺失腐败梭菌α毒素的第212222位共11个氨基酸序列,使其丧失毒力,对腐败梭菌重组α毒素无毒突变体进行体外表达,目的蛋白主要以可溶性形式表达。...
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 引言
1.1 梭菌属概述
1.1.1 梭菌属生物特性
1.1.2 主要致病性梭菌概述
1.2 腐败梭菌研究进展
1.2.1 病原学
1.2.2 流行病学
1.2.3 临床症状
1.2.4 病理变化
1.2.5 致病机理
1.2.6 诊断
1.2.7 防治
1.3 腐败梭菌α毒素
1.3.1 α毒素的理化特性及生物学特性
1.3.2 α毒素的结构与功能
1.3.3 α毒素的免疫原性
1.4 本研究的目的与意义
第二章 腐败梭菌α毒素制备
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌株
2.2.2 主要试剂与耗材
2.3 方法
2.3.1 腐败梭菌天然α毒素制备
2.3.2 重组腐败梭菌α毒素无毒突变体制备
2.4 结果
2.4.1 腐败梭菌天然α毒素制备
2.4.2 重组腐败梭菌α毒素无毒突变体制备
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 单克隆抗体的制备与鉴定
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌株
3.2.2 主要试剂与耗材
3.3 方法
3.3.1 小鼠免疫
3.3.2 细胞融合
3.3.3 单克隆抗体筛选
3.3.4 单克隆抗体亚型鉴定
3.3.5 单克隆抗体针对抗原表位鉴定
3.3.6 细胞中和试验
3.3.7 单克隆抗体的大量制备
3.3.8 单克隆抗体的纯化及效价测定
3.3.9 单克隆抗体特异性鉴定
3.3.10 单克隆抗体亲和常数测定
3.4 结果与分析
3.4.1 小鼠免疫
3.4.2 细胞融合
3.4.3 阳性杂交瘤孔的克隆
3.4.4 杂交瘤细胞的冻存与复苏
3.4.5 单克隆抗体亚型鉴定
3.4.6 单克隆抗体针对抗原表位鉴定
3.4.7 中和试验
3.4.8 腹水制备
3.4.9 单克隆抗体纯化效果鉴定
3.4.10 单克隆抗体特异性鉴定
3.4.11 单克隆抗体亲和常数测定结果
3.5 讨论
3.6 小结
第四章 阻断ELISA检测方法的建立
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌株
4.2.2 主要试剂与耗材
4.3 方法
4.3.1 制备包被抗原
4.3.2 阻断ELISA基本操作步骤
4.3.3 最佳抗原包被浓度以及阴、阳性血清工作浓度的确定
4.3.4 单抗以及酶标抗体工作浓度的确定
4.3.5 包被液以及包被条件的确定
4.3.6 封闭液以及封闭条件的确定
4.3.7 单克隆抗体作用条件的确定
4.3.8 底物显色液作用条件的确定
4.3.9 阴阳性临界值的确定
4.3.10 特异性试验
4.3.11 重复性试验
4.3.12 阻断ELISA与细胞中和试验相关性测定
4.3.13 阻断ELISA与小鼠中和试验相关性测定
4.4 结果
4.4.1 最佳抗原包被浓度以及阴、阳性血清工作浓度的确定
4.4.2 单抗及酶标抗体工作条件的确定
4.4.3 包被液以及包被条件的确定
4.4.4 封闭液以及封闭条件的确定
4.4.5 单抗作用条件的确定
4.4.6 底物显色液作用条件的确定
4.4.7 阴、阳性临界值的确定
4.4.8 特异性试验
4.4.9 重复性试验
4.4.10 阻断ELISA与细胞中和试验相关性
4.4.11 阻断ELISA与小鼠中和试验相关性
4.5 讨论
4.6 小结
第五章 结论
第六章 创新点
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3817317
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 引言
1.1 梭菌属概述
1.1.1 梭菌属生物特性
1.1.2 主要致病性梭菌概述
1.2 腐败梭菌研究进展
1.2.1 病原学
1.2.2 流行病学
1.2.3 临床症状
1.2.4 病理变化
1.2.5 致病机理
1.2.6 诊断
1.2.7 防治
1.3 腐败梭菌α毒素
1.3.1 α毒素的理化特性及生物学特性
1.3.2 α毒素的结构与功能
1.3.3 α毒素的免疫原性
1.4 本研究的目的与意义
第二章 腐败梭菌α毒素制备
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌株
2.2.2 主要试剂与耗材
2.3 方法
2.3.1 腐败梭菌天然α毒素制备
2.3.2 重组腐败梭菌α毒素无毒突变体制备
2.4 结果
2.4.1 腐败梭菌天然α毒素制备
2.4.2 重组腐败梭菌α毒素无毒突变体制备
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 单克隆抗体的制备与鉴定
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 菌株
3.2.2 主要试剂与耗材
3.3 方法
3.3.1 小鼠免疫
3.3.2 细胞融合
3.3.3 单克隆抗体筛选
3.3.4 单克隆抗体亚型鉴定
3.3.5 单克隆抗体针对抗原表位鉴定
3.3.6 细胞中和试验
3.3.7 单克隆抗体的大量制备
3.3.8 单克隆抗体的纯化及效价测定
3.3.9 单克隆抗体特异性鉴定
3.3.10 单克隆抗体亲和常数测定
3.4 结果与分析
3.4.1 小鼠免疫
3.4.2 细胞融合
3.4.3 阳性杂交瘤孔的克隆
3.4.4 杂交瘤细胞的冻存与复苏
3.4.5 单克隆抗体亚型鉴定
3.4.6 单克隆抗体针对抗原表位鉴定
3.4.7 中和试验
3.4.8 腹水制备
3.4.9 单克隆抗体纯化效果鉴定
3.4.10 单克隆抗体特异性鉴定
3.4.11 单克隆抗体亲和常数测定结果
3.5 讨论
3.6 小结
第四章 阻断ELISA检测方法的建立
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 菌株
4.2.2 主要试剂与耗材
4.3 方法
4.3.1 制备包被抗原
4.3.2 阻断ELISA基本操作步骤
4.3.3 最佳抗原包被浓度以及阴、阳性血清工作浓度的确定
4.3.4 单抗以及酶标抗体工作浓度的确定
4.3.5 包被液以及包被条件的确定
4.3.6 封闭液以及封闭条件的确定
4.3.7 单克隆抗体作用条件的确定
4.3.8 底物显色液作用条件的确定
4.3.9 阴阳性临界值的确定
4.3.10 特异性试验
4.3.11 重复性试验
4.3.12 阻断ELISA与细胞中和试验相关性测定
4.3.13 阻断ELISA与小鼠中和试验相关性测定
4.4 结果
4.4.1 最佳抗原包被浓度以及阴、阳性血清工作浓度的确定
4.4.2 单抗及酶标抗体工作条件的确定
4.4.3 包被液以及包被条件的确定
4.4.4 封闭液以及封闭条件的确定
4.4.5 单抗作用条件的确定
4.4.6 底物显色液作用条件的确定
4.4.7 阴、阳性临界值的确定
4.4.8 特异性试验
4.4.9 重复性试验
4.4.10 阻断ELISA与细胞中和试验相关性
4.4.11 阻断ELISA与小鼠中和试验相关性
4.5 讨论
4.6 小结
第五章 结论
第六章 创新点
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3817317
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