重组牛分枝杆菌ESAT6/CFP10蛋白在牛病诊断及细胞活性中的应用研究
发布时间：2023-05-14 08:05
牛结核病是一种主要由牛型分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患传染病，该病被世界动物卫生组织（OIE）列为B类疫病，其传播流行影响着全球畜牧业的持续发展及人类的健康。目前牛结核病临床检测的主要方法是PPD皮肤变态反应，但是PPD与环境中其它分枝杆菌存在交叉反应，导致检测的特异性降低。ESAT6/CFP10是存在于致病性分枝杆菌中的优势抗原，其能引起动物感染早期的细胞免疫，但是在BCG疫苗株与禽结核分枝杆菌株中则没有这种基因编码，由此本研究选择ESAT6/CFP10作为临床诊断牛结核病的目的抗原以提高检测的特异性。 以牛结核分枝杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到目的基因，并克隆至pET32a(+)表达载体中，构建重组质粒，随后将其转化入BL21（DE3）中，经IPTG诱导，得到45kd大小的蛋白。Western blot证实，重组蛋白具有良好的生物活性。Ni-NTA金属离子亲和层析得到纯化的目的蛋白。利用ESAT6/CFP10与牛型提纯结核菌素（PPD-B）对50头假定健康奶牛进行临床对比检测，结果表明， ESAT6/CFP10组的阳性结果与PPD-B组的符合率为84.2%；利用ESAT6...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
英文缩略词
中文摘要
ABSTRACT
1 文献综述
1.1 病原学综述
1.1.1 结核分枝杆菌的分类
1.1.2 结核分枝杆菌的生物学特性
1.1.3 结核分枝杆菌的基因组特点
1.2 牛结核病综述
1.2.1 牛结核病的流行现状
1.2.2 牛结核病的危害
1.2.3 牛结核病的发病及免疫机理
1.3 牛结核病诊断技术综述
1.3.1 细菌学检查方法
1.3.2 免疫学检测方法
1.3.3 分子生物学诊断技术
1.4 ESAT6 与 CFP10 抗原综述
1.4.1 ESAT6 抗原与 CFP10 抗原的发现
1.4.2 ESAT6 抗原与 CFP10 抗原的特质
1.4.3 ESAT6 与 CFP10 作为诊断抗原的研究进展
1.5 研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 主要仪器及试剂
2.1.3 试验动物与细胞
2.2 方法
2.2.1 牛结核分枝杆菌 ESAT6/CFP10 融合基因的 PCR 扩增
2.2.2 原核表达载体 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定
2.2.3 真核表达载体 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定
2.2.4 负载 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 基因的巨噬细胞的制备
2.2.5 重组细菌的诱导表达及其产物的鉴定
2.2.6 重组蛋白的 Western blot 分析
2.2.7 重组蛋白的纯化
2.2.8 注射试剂的稀释
2.2.9 牛结核病皮肤变态反应试验
2.2.10 牛结核病 IFN-γ释放试验
2.2.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 增殖影响的测定
2.2.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生成 NO 能力影响的测定
2.2.13 数据分析与处理
3 结果与分析
3.1 融合基因的 PCR 扩增结果
3.2 重组原核质粒 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的鉴定
3.2.1 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的双酶切鉴定
3.2.2 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的测序结果
3.3 重组真核质粒 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定
3.3.1 重组质粒的双酶切鉴定
3.3.2 重组质粒的测序鉴定
3.4 转染试验及转染阳性 NR8383 巨噬细胞的检测结果
3.5 ESAT6/CFP10 蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中的表达鉴定
3.5.1 重组菌优化表达的结果
3.5.2 重组菌表达形式的分析结果
3.6 重组蛋白 ESAT6/CFP10 的 Western blot 验证结果
3.7 重组蛋白 ESAT6/CFP10 的纯化结果
3.8 纯化重组蛋白的浓度及纯度测定
3.9 皮肤变态反应试验的结果
3.9.1 牛型 PPD 变态反应的结果
3.9.2 重组融合蛋白变态反应的结果
3.10 牛结核病 IFN-γ释放试验的结果
3.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生长影响的测定
3.11.1 ESAT6/CFP10 对未负载细胞增殖影响的结果
3.11.2 ESAT6-CFP10 对负载细胞增殖影响的结果
3.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生成 NO 能力影响的测定
4 讨论
4.1 目的基因的选取
4.2 融合基因的构建
4.3 原核表达载体的选择
4.4 真核表达载体的选择
4.5 纯化介质的选择
4.6 融合蛋白在皮试中的敏感性与特异性
4.7 重组蛋白在 IFN-γ ELISA 试验中的表现
4.8 重组蛋白在细胞试验中的潜在作用
4.9 试验中可能存在的问题
4.9.1 PPD 试验中的测量时间
4.9.2 病原的分离培养
参考文献
附录：常规试剂与培养基的配制
致谢
本文编号：3817497
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
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英文缩略词
中文摘要
ABSTRACT
1 文献综述
1.1 病原学综述
1.1.1 结核分枝杆菌的分类
1.1.2 结核分枝杆菌的生物学特性
1.1.3 结核分枝杆菌的基因组特点
1.2 牛结核病综述
1.2.1 牛结核病的流行现状
1.2.2 牛结核病的危害
1.2.3 牛结核病的发病及免疫机理
1.3 牛结核病诊断技术综述
1.3.1 细菌学检查方法
1.3.2 免疫学检测方法
1.3.3 分子生物学诊断技术
1.4 ESAT6 与 CFP10 抗原综述
1.4.1 ESAT6 抗原与 CFP10 抗原的发现
1.4.2 ESAT6 抗原与 CFP10 抗原的特质
1.4.3 ESAT6 与 CFP10 作为诊断抗原的研究进展
1.5 研究的目的与意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 主要仪器及试剂
2.1.3 试验动物与细胞
2.2 方法
2.2.1 牛结核分枝杆菌 ESAT6/CFP10 融合基因的 PCR 扩增
2.2.2 原核表达载体 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定
2.2.3 真核表达载体 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定
2.2.4 负载 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 基因的巨噬细胞的制备
2.2.5 重组细菌的诱导表达及其产物的鉴定
2.2.6 重组蛋白的 Western blot 分析
2.2.7 重组蛋白的纯化
2.2.8 注射试剂的稀释
2.2.9 牛结核病皮肤变态反应试验
2.2.10 牛结核病 IFN-γ释放试验
2.2.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 增殖影响的测定
2.2.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生成 NO 能力影响的测定
2.2.13 数据分析与处理
3 结果与分析
3.1 融合基因的 PCR 扩增结果
3.2 重组原核质粒 pET-32a（+）-ESAT6/CFP10 的鉴定
3.2.1 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的双酶切鉴定
3.2.2 pET32a（+）-ESAT6/CFP10 的测序结果
3.3 重组真核质粒 pEGFP-N1-ESAT6/CFP10 的构建及鉴定
3.3.1 重组质粒的双酶切鉴定
3.3.2 重组质粒的测序鉴定
3.4 转染试验及转染阳性 NR8383 巨噬细胞的检测结果
3.5 ESAT6/CFP10 蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中的表达鉴定
3.5.1 重组菌优化表达的结果
3.5.2 重组菌表达形式的分析结果
3.6 重组蛋白 ESAT6/CFP10 的 Western blot 验证结果
3.7 重组蛋白 ESAT6/CFP10 的纯化结果
3.8 纯化重组蛋白的浓度及纯度测定
3.9 皮肤变态反应试验的结果
3.9.1 牛型 PPD 变态反应的结果
3.9.2 重组融合蛋白变态反应的结果
3.10 牛结核病 IFN-γ释放试验的结果
3.11 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生长影响的测定
3.11.1 ESAT6/CFP10 对未负载细胞增殖影响的结果
3.11.2 ESAT6-CFP10 对负载细胞增殖影响的结果
3.12 融合蛋白 ESAT6/CFP10 对 NR8383 生成 NO 能力影响的测定
4 讨论
4.1 目的基因的选取
4.2 融合基因的构建
4.3 原核表达载体的选择
4.4 真核表达载体的选择
4.5 纯化介质的选择
4.6 融合蛋白在皮试中的敏感性与特异性
4.7 重组蛋白在 IFN-γ ELISA 试验中的表现
4.8 重组蛋白在细胞试验中的潜在作用
4.9 试验中可能存在的问题
4.9.1 PPD 试验中的测量时间
4.9.2 病原的分离培养
参考文献
附录：常规试剂与培养基的配制
致谢
本文编号：3817497
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3817497.html
