丝状支原体丝状亚种P19蛋白粘附特性的研究

发布时间：2023-05-18 03:38

　　丝状支原体丝状亚种(Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides Small Colony,Mmm)是牛传染性胸膜肺炎(contagious bovine pleuropneumonia, CBPP)的病原。CBPP是世界动物卫生组织规定的需报告传染病,目前,该病在非洲很多国家仍是一种重要的动物传染病。中国利用Mmm中国分离株Ben-1在兔或绵羊体内连续传代研制成“兔化绵羊化弱毒疫苗”并成功控制了CBPP的流行,于2011年5月被世界动物卫生组织宣布为无牛肺疫国家,但目前Mmm传代致弱的机制仍不明确。 本研究小组结合下一代测序技术以及比较基因组学,对Mmm中国分离株强毒株Ben-1以及致弱毒株Ben-470进行全基因组测序及序列比对,发现Ben-1和Ben-470之间存在30kb的基因缺失,从而推测这些基因的缺失可能与Ben-1菌株的毒力减弱相关。 在Ben-1和Ben-470基因组之间缺失的30kb片段中,我们选取其中的一个差异基因p19进行研究。本研究利用PCR、RT-PCR以及Dot blot杂交对p19基因在Ben-1和Ben-470全基因组中的差异情...

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 丝状支原体丝状亚种(Mmm)概述
    1.2 牛传染性胸膜肺炎(CBPP)概述
        1.2.1 牛传染性胸膜肺炎概述
        1.2.2 牛传染性胸膜肺炎的流行病学
        1.2.3 中国弱毒CBPP疫苗的研制
        1.2.4 绵羊、藏绵羊化疫苗的发展和应用
    1.3 丝状支原体丝状亚种的致病分子机制
        1.3.1 丝状支原体丝状亚种的致病分子机制概述
        1.3.2 丝状支原体丝状亚种的免疫原性
        1.3.3 分泌型多糖以及荚膜多糖
        1.3.4 表面蛋白
        1.3.5 粘附因子
        1.3.6 表面可变蛋白
        1.3.7 毒素代谢通路产物
        1.3.8 细菌毒力的分解代谢物阻碍作用
    1.4 本研究的目的和意义
第二章 P19的序列分析及原核表达
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要设备仪器
        2.1.4 主要溶液及配置
    2.2 方法
        2.2.1 P19及其基因的序列分析
        2.2.2 Mmm基因组DNA的提取以及cDNA的制备
        2.2.3 p19基因的克隆
        2.2.4 p19基因的Dot blot杂交
        2.2.5 pET28a-p19重组质粒的构建及鉴定
        2.2.6 重组质粒pET-28a-p19的表达
        2.2.7 rP19可溶性判断
        2.2.8 rP19的纯化
    2.3 结果
        2.3.1 P19及其基因的序列分析
        2.3.2 p19基因克隆与分析
        2.3.3 p19基因的Dot blot杂交
        2.3.4 pET-28a-p19重组质粒的构建与鉴定
        2.3.5 rP19的原核表达与纯化
    2.4 小结
    2.5 讨论
第三章 P19多克隆抗体制备及亚细胞定位
    3.1 材料
        3.1.1 主要试剂
        3.1.2 实验设备
        3.1.3 相关溶液及配制方法
    3.2 方法
        3.2.1 兔抗rP19多克隆抗体的制备
        3.2.2 兔抗rP19血清效价的测定
        3.2.3 Mmm的细胞总蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白组分的提取
        3.2.4 Mmm P19的细胞定位
    3.3 结果
        3.3.1 兔抗rP19血清效价的测定
        3.3.2 Mmm P19的细胞定位
    3.4 小结
    3.5 讨论
第四章 P19对宿主细胞粘附特性及免疫功能的研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株与细胞
        4.1.2 试剂
        4.1.3 血清
        4.1.4 主要仪器
    4.2 方法
        4.2.1 rP19粘附EBL细胞
        4.2.2 夹心ELISA实验
        4.2.3 rP19的Western Blot检测
        4.2.4 rP19的ELISA检测
        4.2.5 P19刺激EBL细胞
        4.2.6 SYBR Green I实时定量PCR
        4.2.7 相对mRNA表达水平的计算
    4.3 结果
        4.3.1 rP19粘附EBL细胞
        4.3.2 夹心ELISA实验
        4.3.3 rP19的Western Blot检测
        4.3.4 rP19的ELISA检测
        4.3.5 rP19激活EBL细胞IL-1β和TNF-α的mRNA上调表达
    4.4 结论
    4.5 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3818594