弓形虫RH株ROP18基因的原核表达及鉴定

发布时间：2023-05-20 12:04

　　为了研究刚地弓形虫ROP18的生物学功能,并深入了解其在抵抗宿主天然免疫方面所发挥的作用,本研究进行了弓形虫RH株ROP18基因的表达与鉴定。采用PCR方法扩增ROP18的截短基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot及IFA鉴定重组蛋白的免疫活性。结果表明:以弓形虫RH株基因组DNA为模板,成功扩增出长约678 bp的ROP18截短基因,并构建了原核表达质粒pET-30a-ROP18,测序结果与GenBank参考序列比对,同源性为100%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白ROP18以包涵体形式存在,分子质量约为31 kDa,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L、37℃诱导表达6 h时,表达量最高;Western blot结果显示重组蛋白ROP18可被感染弓形虫的犬阳性血清识别,表明ROP18有良好的反应原性;IFA结果显示,ROP18主要分布于弓形虫速殖子的胞浆内,且棒状体常存在的部位呈现较强荧光...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 弓形虫虫株、菌种、质粒与小鼠
    1.2 试剂与仪器
    1.3 弓形虫DNA的提取
    1.4 引物的设计与合成
    1.5 ROP18基因的扩增
    1.6 重组质粒pET-30a-ROP18的构建及鉴定
    1.7 重组蛋白的表达及可溶性鉴定
    1.8 重组蛋白ROP18的纯化
    1.9 鼠抗重组蛋白ROP18多克隆抗体的制备
    1.10 重组蛋白ROP18的Western blot分析
    1.11 重组蛋白ROP18的间接免疫荧光试验分析
2 结果
    2.1 ROP18基因的扩增
    2.2 重组质粒的鉴定
        2.2.1 重组质粒的PCR鉴定
        2.2.2 重组质粒的双酶切鉴定
    2.3 重组蛋白的表达及可溶性鉴定
    2.4 重组蛋白rROP18纯化后SDS-PAGE分析
    2.5 重组蛋白rROP18的Western blot分析
    2.6 间接免疫荧光试验分析
3 讨论



本文编号：3821080