兔痒螨肌动蛋白和肌钙蛋白C基因的克隆表达及应用研究

发布时间：2023-05-20 12:24

　　痒螨病主要是由痒螨寄生于哺乳动物的皮肤表面,以刺吸宿主的体液、淋巴液和渗出液为营养,引起患病动物的一种慢性、顽固性、接触性、传染性皮肤病。痒螨病常见的临床症状有剧痒、结痂、脱毛和皮肤肥厚,进而影响进食和休息,导致消瘦,严重时可引起继发感染并死亡。目前,治疗该病的方法主要是化学药物疗法。但是,药物疗法不仅费用高昂,还会使寄生虫产生耐药性,防控效果不理想。不仅如此,畜产品中的药物残留对人体和自然环境的危害都不容小觑。因此,国内外学者都在不停地寻找更安全高效的新兴防控办法,包括：植物提取物杀螨、生物杀螨和疫苗。而疫苗,是目前研发进展最慢,技术难度最高,同时也是最充满希望的新手段,更是近年来世界各地学者研究最热的焦点之一。目前该病的诊断方法首先是根据临床症状进行判断,如出现剧痒、皮肤增厚、有痂皮、脱毛和消瘦等特征,可做出初步诊断。确诊还需进一步病原学和免疫学诊断。在前人研究工作的基础上,本论文进行了兔痒螨肌动蛋白基因和兔痒螨肌钙蛋白C基因的研究,取得的研究成果如下：一、兔痒螨肌动蛋白基因的克隆表达及免疫保护研究本研究中,我们克隆了兔痒螨肌动蛋白基因,并成功表达了重组蛋白(rPc-act)。序列...

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1. 动物痒螨免疫学研究进展
        1.1 抗原
        1.2 免疫应答
            1.2.1 体液免疫
            1.2.2 细胞免疫
        1.3 宿主与痒螨在感染过程中的相互作用
        1.4 痒螨疫苗的研发进展
    2. 本研究的目的和意义
第二章 兔痒螨肌动蛋白的克隆表达,免疫定位及其免疫保护效力评估
    摘要
    引言
    1. 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 兔痒螨和实验兔
            1.1.2 载体、菌株和主要试剂
            1.1.3 主要仪器设备
            1.1.4 常用溶液的配制
            1.1.5 主要生物信息数据库和分子生物学软件
        1.2 试验方法
            1.2.1 兔痒螨肌动蛋白的克隆
                1.2.1.1 兔痒螨的采集
                1.2.1.2 兔痒螨总RNA的提取
                1.2.1.3 引物设计
                1.2.1.4 肌动蛋白基因的RT-PCR扩增
                1.2.1.5 PCR产物的纯化回收
                1.2.1.6 目的基因的连接转化
                1.2.1.7 菌落PCR鉴定
                1.2.1.8 目的基因测序和分析
            1.2.2 兔痒螨肌动蛋白的表达载体构建
                1.2.2.1 表达引物的设计
                1.2.2.2 表达基因的亚克隆
                1.2.2.3 重组T克隆质粒的构建
                1.2.2.4 肌动蛋白质粒提取与酶切
                1.2.2.5 pET32a(+)质粒的提取与酶切
                1.2.2.6 酶切后的肌动蛋白质粒与酶切后的pET32a(+)质粒连接转化
                1.2.2.7 重组表达质粒酶切鉴定
            1.2.3 重组pET32a(+)-act的原核表达
                1.2.3.1 重组蛋白的表达
                1.2.3.2 SDS-PAGE分析
                1.2.3.3 表达条件优化
                1.2.3.4 表达重组蛋白的可溶性分析
            1.2.4 重组蛋白纯化
            1.2.5 重组蛋白的免疫印迹
                1.2.5.1 一抗血清的制备
                1.2.5.2 SDS-PAGE电泳
                1.2.5.3 电转移
                1.2.5.4 免疫反应
            1.2.6 高免血清的制备
            1.2.7 蛋白定位
            1.2.8 免疫保护实验
    2 结果
        2.1 兔痒螨肌动蛋白基因的克隆
            2.1.1 兔痒螨肌动蛋白基因的PCR扩增
            2.1.2 序列比对分析
            2.1.3 兔痒螨肌动蛋白生物信息学分析
        2.2 痒螨肌动蛋白基因的原核表达
            2.2.1 表达条件优化
            2.2.2 重组蛋白可溶性分析
        2.3 免疫印迹结果
        2.4 蛋白定位
        2.5 免疫保护实验结果
    3 讨论
        3.1 兔痒螨肌动蛋白基本特征分析
        3.2 特异性IgG水平分析
        3.3 总IgE水平分析
        3.4 痒螨免疫机制探讨
第三章 兔痒螨肌钙蛋白C的克隆表达和诊断价值评估
    摘要
    引言
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 兔痒螨和实验兔
            1.1.2 载体、菌株和主要试剂
            1.1.3 主要仪器设备
            1.1.4 常用溶液的配制
            1.1.5 主要生物信息数据库和分子生物学软件
        1.2 试验方法
            1.2.1 兔痒螨肌钙蛋白C的克隆
                1.2.1.1 兔痒螨的采集
                1.2.1.2 兔痒螨总RNA的提取
                1.2.1.3 引物设计
                1.2.1.4 肌钙蛋白C基因的RT-PCR扩增
                1.2.1.5 PCR产物的纯化回收
                1.2.1.6 目的基因的连接转化
                1.2.1.7 菌落PCR鉴定
                1.2.1.8 目的基因测序和分析
            1.2.2 兔痒螨肌钙蛋白C的表达载体构建
                1.2.2.1 表达引物的设计
                1.2.2.2 表达基因的亚克隆
                1.2.2.3 重组T克隆质粒的构建
                1.2.2.4 肌钙蛋白C质粒提取与酶切
                1.2.2.5 pET32a(+)质粒的提取与酶切
                1.2.2.6 酶切后的肌钙蛋白C质粒与酶切后的pET32a(+)质粒连接转化
                1.2.2.7 重组表达质粒酶切鉴定
            1.2.3 重组pET32a(+)-tro的原核表达
                1.2.3.1 重组蛋白的表达
                1.2.3.2 SDS-PAGE分析
                1.2.3.3 表达条件优化
                1.2.3.4 表达重组蛋白的可溶性分析
            1.2.4 重组蛋白纯化
            1.2.5 重组蛋白的免疫印迹
                1.2.5.1 一抗血清的制备
                1.2.5.2 SDS-PAGE电泳
                1.2.5.3 电转移
                1.2.5.4 免疫反应
            1.2.6 Dot-ELISA诊断
    2 结果
        2.1 兔痒螨肌钙蛋白C基因的克隆
            2.1.1 兔痒螨肌钙蛋白C基因的PCR扩增
            2.1.2 兔痒螨肌钙蛋白C生物信息学分析
        2.2 痒螨肌钙蛋白基因的原核表达
            2.2.1 表达条件优化
            2.2.2 重组蛋白可溶性分析
        2.3 免疫印迹结果
        2.4 Dot-ELISA诊断
    3 讨论
        3.0 肌钙蛋白C序列分析
        3.1 肌钙蛋白C与已知变应原交叉反应性预测分析
        3.2 肌钙蛋白C作为诊断抗原的潜力分析
        3.3 Dot-ELISA交叉反应性分析
        3.4 评估方法可靠性分析
第四章 结论与创新点
    1. 结论
    2. 创新点
参考文献
致谢
研究生期间发表论文



本文编号：3821107