沉默TRPV6基因对鸡成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响

发布时间：2023-05-21 18:23

　　成骨细胞是蛋鸡髓质骨形成的主要功能细胞,其功能受钙离子的调节。Transient receptor potential vanilloid 6 (TRPV6)是钙离子跨细胞转运的限速“门控”通道。目前有关TRPV6对成骨细胞影响的报道主要集中在鼠及人类方面,对禽类国内、外很少报道。因此,本试验通过将沉默TRPV6基因的质粒转染至鸡成骨细胞,检测TRPV6对成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,旨在为探索蛋鸡髓质骨形成提供理论基础。两次酶消化法培养鸡成骨细胞,并用碱性磷酸酶染色及钙化结节染色法鉴定培养的细胞。取16日龄鸡胚颅骨,0.1%胰酶消化15 min后,剪碎,再用0.1%Ⅱ型胶原酶消化1h,获取鸡胚额骨成骨细胞群并鉴定。采用NBT/BCIP碱性磷酸酶染色试剂盒法对碱性磷酸酶进行染色,茜素红法鉴定钙化结节。选取生长状态良好的成骨细胞,接种于96孔板,培养24 h,同时将成骨细胞分为3个试验组,分别为用脂质体法转染沉默TRPV6基因质粒组(TRPV6-shRNA质粒,转染试剂,成骨细胞)、转染未沉默TRPV6基因质粒组(negative-shRNA质粒,转染试剂,成骨细胞)及未转染组(转染试...

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语
前言
上篇 文献综述
    第一章 钙离子通道TRPV6研究进展
        1 TRPV6的发现
        2 TRPV6的结构和分布
        3 TRPV6的功能
    第二章 蛋鸡髓质骨形成与成骨细胞的作用
        1 骨生长期
        2 产蛋期
    参考文献
下篇 试验研究
    第三章 鸡成骨细胞的分离培养与鉴定
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验动物
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 鸡成骨细胞的分离培养
                1.2.2 鸡成骨细胞的鉴定
        2 结果与分析
            2.1 鸡成骨细胞形态
            2.2 碱性磷酸酶染色
            2.3 茜素红法鉴定钙化结节
        3 讨论
            3.1 鸡胚成骨细胞培养方法的完善
            3.2 鸡成骨细胞的鉴定
        4 小结
    第四章 TRPV6对鸡成骨细胞增殖、分化的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验动物
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 鸡成骨细胞的分离培养
                1.2.2 培养的成骨细胞的鉴定
                1.2.3 质粒转染成骨细胞
                1.2.4 MTT法测定细胞增殖率
                1.2.5 碱性磷酸酶活性定量测定(PNPP法)
                1.2.6 BCA法测定蛋白质含量
                1.2.7 统计学处理
        2 结果
            2.1 转染成骨细胞
            2.2 TRPV6对成骨细胞增殖的影响
            2.3 TRPV6对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响
        3 讨论
        4 小结
    第五章 TRPV6对鸡成骨细胞凋亡的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验动物
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 鸡成骨细胞的分离培养、鉴定及转染
                1.2.2 Annexin V-FITC/PI双染法检测鸡成骨细胞凋亡
        2 结果
            2.1 分离培养的成骨细胞观察、鉴定及转染
            2.2 TRPV6对鸡成骨细胞凋亡的影响
        3 讨论
        4 小结
    第六章 TRPV6对鸡成骨细胞相关基因mRNA及蛋白表达的影响
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验动物
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 方法
                1.2.1 鸡成骨细胞的分离培养和鉴定及转染
                1.2.2 实时荧光定量PCR检测TRPV6相关基因mRNA表达
                1.2.3 Western blot检测TRPV6相关基因蛋白表达
                1.2.4 统计学分析
        2 结果
            2.1 TRPV6对成骨细胞相关基因mRNA表达的影响
        4 小结
    参考文献
全文总结
本论文创新之处
附录
致谢
在读硕士研究生期间发表文章及获奖情况



本文编号：3821217