芒草驯养牛瘤胃未培养微生物中CMCase的克

发布时间：2023-05-21 19:11

　　现代社会不断发展,随之出现的问题是社会经济增长与环境保护、生存发展与能源消耗之间的矛盾愈发突出。传统能源的开采力度不断增加,使许多不可再生资源总量不断减少,所带来的污染问题也愈发严重,目前最急迫需要解决的问题便是努力探索和发展新能源,而生物质能源作为新生代能源之一,将为人类社会解决能源与环境问题做出卓越贡献。本研究通过提取芒草驯养的湘西黄牛瘤胃内容物总DNA,构建宏基因组文库并采用功能筛选法从文库中挖掘新型纤维素酶基因资源,获得研究结果如下： 应用功能筛选法筛选宏基因组文库中具有CMCase的克隆,得到一个功能活性克隆,编号为185C10。对此克隆包含的外源片段进一步进行亚克隆,最终获得一段2162bp的核苷酸序列,经过生物信息学软件预测分析,该片段包含长为1731bp的ORF,将该基因定名为uncel185C10,编码576个氨基酸,该基因编码蛋白Uncel185C10的分子质量为62654.2Daltons,等电点pI为4.90,该编码蛋白无信号肽序列,说明uncel185C10可能编码的是胞内酶。通过SMART分析,结果预测该蛋白中第1-300个氨基酸是糖基水解酶家族8高度保守结...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
目录
第一章 文献综述及前言
    1 能源植物—芒草的研究与发展战略
        1.1“绿金”代“黑金”的必然性
        1.2 能源植物新秀—芒草
        1.3 我国能源植物芒草的发展战略
    2 瘤胃未培养微生物及纤维素分解菌
        2.1 未培养微生物
        2.2 瘤胃微生物
            2.2.1 瘤胃细菌
            2.2.2 瘤胃原虫
            2.2.3 瘤胃真菌
            2.2.4 瘤胃微生物基因组信息
    3 瘤胃微生物纤维素酶
        3.1 瘤胃微生物纤维素酶的组成
        3.2 芒草驯养对发掘牛瘤胃微生物纤维素酶的意义
    4 宏基因组学——探索未培养微生物资源的重要途径
        4.1 宏基因组学研究策略
        4.2 宏基因组学研究应用进展
            4.2.1 在胃肠道微生物资源挖掘上的应用
            4.2.2 在口腔微生物研究领域中的应用
            4.2.3 在植物病害生物防治中的应用
            4.2.4 在自然环境微生物资源挖掘上的应用
        4.3 宏基因组技术存在的问题及展望
    5 本论文立题依据、研究目标及技术路线
        5.1 题依据
        5.2 研究目标
        5.3 技术路线
第二章 材料与方法
    1 材料
        1.1 实验动物及饲养
        1.2 实验仪器设备
        1.3 实验药品及试剂
    2 方法
        2.1 宏基因组Fosmid文库克隆子的提取和保存
            2.1.1 Fosmid文库克隆子的提取
            2.1.2 Fosmid文库克隆子的保存
        2.2 Fosmid文库筛选
        2.3 克隆文库的构建
            2.3.1 Fosmid克隆质粒的提取
            2.3.2 pUC质粒载体制备
            2.3.3 目的片段酶切产物与pUC19载体的连接
            2.3.4 连接产物的转化
            2.3.5 克隆文库的筛选
        2.4 菌液PCR检测
        2.5 功能基因序列分析
        2.6 原核表达载体的构建
            2.6.1 扩增功能基因的编码序列
            2.6.2 PCR扩增
            2.6.3 pET30a(+)质粒载体的提取
            2.6.4 制备感受态
            2.6.5 酶切体系
            2.6.6 目的基因片段与表达载体DNA连接及转化
        2.7 诱导表达条件的优化
            2.7.1 最佳诱导剂剂量的确定
            2.7.2 最佳诱导温度的确定
            2.7.3 最佳诱导时间的确定
        2.8 CMCase酶学性质初步研究
            2.8.1 CMCase酶活力的测定
            2.8.2 绘制标准曲线
            2.8.3 酶活测定
            2.8.4 粗酶液最适pH值的测定
            2.8.5 粗酶液最适反应温度的测定
            2.8.6 热稳定性的研究
            2.8.7 pH稳定性的研究
            2.8.8 金属离子对酶活力的影响
第三章 结果与分析
    1 Fosmid文库的筛选
    2 亚克隆文库构建与筛选
        2.1 目的片段酶切产物与pUC19载体的连接
        2.2 亚克隆文库筛选结果
        2.3 菌液PCR检测
    3 亚克隆序列分析
        3.1 序列及其编码氨基酸序列分析
        3.2 理化性质分析
        3.3 功能结构域分析
        3.4 信号肽分析
        3.5 Uncel185C10系统进化分析
    4 功能基因的原核表达
        4.1 构建目的基因表达载体
        4.2 重组质粒酶切验证
        4.3 基因工程菌功能验证
    5 诱导条件的优化
        5.1 最佳诱导剂剂量的确定
        5.2 最佳诱导温度的确定
        5.3 最佳诱导时间的确定
    6 CMCase酶学性质分析
        6.1 最适反应pH的确定
        6.2 最适反应温度的确定
        6.3 CMCase的pH稳定性
        6.4 CMCase的温度稳定性
        6.5 金属离子对酶活力
第四章 讨论
第五章 结论、创新点及下一步工作计划
    1 结论
    2 创新点
    3 下一步工作计划
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3821287