嵌合犬冠状病毒N、S基因的重组狂犬病病毒的拯救与鉴定

发布时间：2023-06-03 07:37

　　狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性人兽共患病,一旦感染出现临床症状病死率为100%。犬冠状病毒病是由犬冠状病毒感染引起犬的一种接触性传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水和血便为主要特征,致死率较低,但与其他传染病如犬细小病毒、轮状病毒等混合感染时死亡率明显提高。本研究利用原核表达系统表达了犬冠状病毒N蛋白,免疫兔子后制备多克隆抗体,经过ELISA、Western blotting等试验鉴定,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体具有良好的反应特异性。本论文主要基于狂犬病病毒反向遗传操作系统研制狂犬病和犬冠状病毒病二联基因工程疫苗。以狂犬病病毒弱毒SAD毒株为骨架,分别在狂犬病毒的N、P基因之间插入犬冠状病毒N和S基因,构建狂犬病毒全长cDNA,然后与辅助质粒按一定的比例共转染BHK-21细胞拯救重组病毒,通过免疫荧光和qPCR试验筛选出含有目的基因的重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N和BNSP-CCV-S,然后对重组病毒的生物学特性进行了鉴定,Western blotting试验和免疫荧光试验表明重组病毒BNSP-CCV-N可同时表达RV-G蛋白和CCV-...

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 狂犬病概述
        1.1.1 狂犬病
        1.1.2 狂犬病流行病学
        1.1.3 狂犬病临床症状与致病机理
        1.1.4 狂犬病毒基因组结构和编码蛋白
        1.1.5 狂犬疫苗研究进展
    1.2 犬冠状病毒病概述
        1.2.1 冠状病毒概述
        1.2.2 犬冠状病毒的临床症状与致病机理
        1.2.3 犬冠状病毒基因组结构和编码蛋白
        1.2.4 冠状病毒疫苗研究进展
    1.3 RNA病毒的反向遗传操作和应用
        1.3.1 正链RNA病毒的反向遗传操作技术
        1.3.2 负链RNA病毒的反向遗传操作技术
第二章 犬冠状病毒N基因的原核表达及多克隆抗体制备
    2.1 材料与方法
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 N基因密码子优化及其重组表达质粒p ET-B2M-N的构建
        2.1.3 CCVN蛋白的诱导表达
        2.1.4 免疫动物
        2.1.5 血清抗体效价的ELISA测定
        2.1.6 抗体纯化
        2.1.7 Western blotting检测
    2.2 结果与分析
        2.2.1 重组质粒的成功构建
        2.2.2 重组N蛋白的诱导表达
        2.2.3 多克隆抗体ELISA效价
        2.2.4 抗体纯化结果
        2.2.5 Western blotting检测结果
    2.3 讨论
第三章 重组狂犬病病毒BNSP-CCV-N的拯救及生物学特性研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 质粒、细胞、病毒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 引物设计与合成
        3.1.4 PCR扩增犬冠状病毒N基因
        3.1.5 含犬冠状病毒N基因的重组狂犬病病毒基因组全长cDNA克隆的构建
        3.1.6 重组病毒的拯救
        3.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒
        3.1.8 实时荧光定量qPCR试验
        3.1.9 重组病毒的传代和外源基因稳定性检测
        3.1.10 重组病毒毒价测定以及生长曲线的测定
        3.1.11 重组病毒浓缩、纯化
        3.1.12 Western blotting鉴定外源蛋白表达
        3.1.13 激光共聚焦观察和电镜观察
    3.2 结果
        3.2.1 犬冠状病毒N基因的扩增结果
        3.2.2 全长cDNA构建结果
        3.2.3 qPCR鉴定重组病毒结果
        3.2.4 免疫荧光鉴定重组病毒结果
        3.2.5 重组病毒生长曲线的测定结果
        3.2.6 重组病毒的电镜观察结果
        3.2.7 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果
        3.2.8 外源基因稳定性检测结果
    3.3 讨论
第四章 重组狂犬病病毒BNSP-CCV-S的拯救及生物学特性研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 质粒、细胞、病毒
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 引物设计与合成
        4.1.4 PCR扩增犬冠状病毒S1、S2、S3 基因
        4.1.5 含犬冠状病毒S1、S2、S3 基因的重组狂犬病病毒基因组全长c DNA克隆的构建
        4.1.6 重组病毒的拯救
        4.1.7 免疫荧光鉴定重组病毒
        4.1.8 实时荧光定量qPCR试验
        4.1.9 重组病毒的传代和外源基因稳定性检测
        4.1.10 重组病毒毒价测定以及生长曲线的测定
        4.1.11 Western blotting鉴定外源蛋白表达
        4.1.12 重组病毒浓缩、纯化
        4.1.13 激光共聚焦观察和电镜观察
    4.2 结果
        4.2.1 犬冠状病毒S1、S2、S3基因的扩增结果
        4.2.2 全长cDNA构建结果
        4.2.3 qPCR鉴定重组病毒结果
        4.2.4 免疫荧光鉴定重组病毒结果
        4.2.5 重组病毒生长曲线的测定结果
        4.2.6 BNSP-CCV-S重组病毒的电镜观察结果
        4.2.7 Western Blotting鉴定外源蛋白的表达结果
        4.2.8 外源基因稳定性检测结果
    4.3 讨论
第五章 重组病毒对小鼠的致病性及免疫效果评价
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验动物、病毒
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 重组病毒对小鼠的致病性研究
        5.1.4 疫苗的制备与免疫试验
        5.1.5 RFFIT检测狂犬病毒的中和抗体
        5.1.6 间接ELISA方法检测N、S抗体
    5.2 结果
        5.2.1 重组病毒对小鼠致病性结果
        5.2.2 RFFIT检测狂犬病毒的中和抗体结果
        5.2.3 间接ELISA检测犬冠状病毒特异性抗体结果
    5.3 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3828917