牛环形泰勒虫表面抗原靶基因片段的筛
发布时间：2023-06-05 00:30
牛环形泰勒虫病是由环形泰勒虫（Theileria annulata）寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内引起的以贫血、稽留热为主要临床症状的一种蜱传血液性原虫病。迄今为止，还没有防治环形泰勒虫病的特效药物，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区呈逐年上升趋势，严重影响了养牛业的发展。因此，在牛环形泰勒虫病的防控工作中，在筛选病原表面抗原靶基因的基础上，研发高灵敏度及高通量的检测技术就显得尤为重要。本研究进行了如下三方面的研究工作： （ⅰ）本研究，根据GenBank中已发表的牛环形泰勒虫Tams1基因序列，设计合成5对引物，采用基因工程技术分别扩增Tams1基因的全长基因（AE）、无N端及C端疏水区（BC）、仅缺乏N端疏水区（BE）片段，从而构建原核表达重组质粒。结果显示：成功地扩增了Tams1基因的AE、BC、BE等片段，构建了pGEX-4T-2-BE，pGEX-4T-2-BC，pGEX-4T-2-AE、pET-28a-BC，pET-28a-BE，pET-30a-BC，pET-30a-BE等7种原核表达重组质粒；测序结果表明克隆的Tams1序列及推导氨基酸序...
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 环形泰勒虫病的研究进展
1.1 环形泰勒虫病的概况
1.1.1 病原形态
1.1.2 生活史
1.1.3 免疫及生化指标影响
1.1.4 临床症状及病理变化
1.1.5 流行病学
1.1.6 防治
1.2 环形泰勒虫病诊断方法研究进展
1.2.1 病原学诊断
1.2.2 血清学诊断
1.2.3 分子生物学诊断
1.3 本课题研究的目的意义
第2章 环形泰勒虫新疆株 Tams1 基因片段的克隆表达及筛选
2.1 试验材料
2.1.1 样品来源
2.1.2 菌种及质粒
2.1.3 试剂及工具酶
2.1.4 主要仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 牛环形泰勒虫新疆流行株的分离获得
2.2.2 环形泰勒虫 Tams1 基因序列分析及引物设计
2.2.3 全血基因组 DNA 的提取
2.2.4 环形泰勒虫 Tams1 基因的 PCR 扩增
2.2.5 PCR 产物的回收与纯化
2.2.6 重组表达载体的构建
2.2.7 重组表达质粒的转化
2.2.8 重组表达质粒的筛选与鉴定
2.2.9 目的基因序列测定
2.2.10 重组表达质粒的诱导表达
2.2.11 高效可溶性表达重组质粒的筛选
2.2.12 诱导条件的优化
2.2.13 目的蛋白的纯化
2.2.14 Western blotting 分析
2.3 结果与分析
2.3.1 牛环形泰勒虫 Tams1 基因的扩增
2.3.2 重组表达质粒的鉴定结果
2.3.3 目的基因 Tams1 的测序分析结果
2.3.4 高效可溶性表达重组质粒的筛选
2.3.5 诱导条件的优化结果
2.3.6 目的蛋白的纯化及鉴定
2.3.7 目的蛋白的纯化及鉴定
2.4 讨论与分析
2.4.1 Tams1 基因亚克隆抗原位点的选择及序列分析
2.4.2 表达载体的选择
2.4.3 Western blotting 分析
2.5 小结
第3章 牛环形泰勒虫病间接 ELISA 检测方法的建立及初步应用
3.1 试验材料
3.1.1 抗原及血清
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 临床样品来源
3.2 试验方法
3.2.1 His-BE 蛋白的定量
3.2.2 间接 ELISA 方法的建立
3.3 结果与分析
3.3.1 His-BE 蛋白浓度的测定
3.3.2 最佳包被缓冲液的选择结果
3.3.3 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定结果
3.3.4 包被条件的确定结果
3.3.5 最佳封闭液及封闭时间的确定
3.3.6 血清最佳作用时间的确定
3.3.7 酶标二抗最佳工作浓度和时间的确定
3.3.8 底物作用时间的确定
3.3.9 阴阳性临界值的确定
3.3.10 间接 ELISA 方法评测的结果
3.3.11 样品检测结果
3.4 讨论与分析
3.4.1 间接 ELISA 条件的优化
3.4.2 间接 ELISA 方法的特点
3.5 小结
第4章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3831327
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 环形泰勒虫病的研究进展
1.1 环形泰勒虫病的概况
1.1.1 病原形态
1.1.2 生活史
1.1.3 免疫及生化指标影响
1.1.4 临床症状及病理变化
1.1.5 流行病学
1.1.6 防治
1.2 环形泰勒虫病诊断方法研究进展
1.2.1 病原学诊断
1.2.2 血清学诊断
1.2.3 分子生物学诊断
1.3 本课题研究的目的意义
第2章 环形泰勒虫新疆株 Tams1 基因片段的克隆表达及筛选
2.1 试验材料
2.1.1 样品来源
2.1.2 菌种及质粒
2.1.3 试剂及工具酶
2.1.4 主要仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 牛环形泰勒虫新疆流行株的分离获得
2.2.2 环形泰勒虫 Tams1 基因序列分析及引物设计
2.2.3 全血基因组 DNA 的提取
2.2.4 环形泰勒虫 Tams1 基因的 PCR 扩增
2.2.5 PCR 产物的回收与纯化
2.2.6 重组表达载体的构建
2.2.7 重组表达质粒的转化
2.2.8 重组表达质粒的筛选与鉴定
2.2.9 目的基因序列测定
2.2.10 重组表达质粒的诱导表达
2.2.11 高效可溶性表达重组质粒的筛选
2.2.12 诱导条件的优化
2.2.13 目的蛋白的纯化
2.2.14 Western blotting 分析
2.3 结果与分析
2.3.1 牛环形泰勒虫 Tams1 基因的扩增
2.3.2 重组表达质粒的鉴定结果
2.3.3 目的基因 Tams1 的测序分析结果
2.3.4 高效可溶性表达重组质粒的筛选
2.3.5 诱导条件的优化结果
2.3.6 目的蛋白的纯化及鉴定
2.3.7 目的蛋白的纯化及鉴定
2.4 讨论与分析
2.4.1 Tams1 基因亚克隆抗原位点的选择及序列分析
2.4.2 表达载体的选择
2.4.3 Western blotting 分析
2.5 小结
第3章 牛环形泰勒虫病间接 ELISA 检测方法的建立及初步应用
3.1 试验材料
3.1.1 抗原及血清
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 临床样品来源
3.2 试验方法
3.2.1 His-BE 蛋白的定量
3.2.2 间接 ELISA 方法的建立
3.3 结果与分析
3.3.1 His-BE 蛋白浓度的测定
3.3.2 最佳包被缓冲液的选择结果
3.3.3 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定结果
3.3.4 包被条件的确定结果
3.3.5 最佳封闭液及封闭时间的确定
3.3.6 血清最佳作用时间的确定
3.3.7 酶标二抗最佳工作浓度和时间的确定
3.3.8 底物作用时间的确定
3.3.9 阴阳性临界值的确定
3.3.10 间接 ELISA 方法评测的结果
3.3.11 样品检测结果
3.4 讨论与分析
3.4.1 间接 ELISA 条件的优化
3.4.2 间接 ELISA 方法的特点
3.5 小结
第4章 结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3831327
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