家猪肿瘤坏死因子（TNF-α）突变体基因的构建、表达及生物学活性的鉴定

发布时间：2023-06-10 12:43

　　肿瘤坏死因子(TNF-α)是激活的单核-巨噬细胞分泌的一种细胞因子,它具有广泛的生物学活性,因此从发现至今一直是研究的重点。但是其生物学活性的两面性,又使它在临床应用中有很大的限制,于是人们通过构建其突变体的方法,以期增强其抗肿瘤活性并降低其毒副作用。本实验就是在对人TNF-α研究的基础上进行的。我们首先获得了家猪TNF-α基因的CDS区全长,通过PCR的方法构建得到了前7个氨基酸残基缺失,8位Ser、9位Asp、156位Leu分别突变为Lys、Arg和Phe的TNF-α突变体基因(标记为PmTNF-α)。分别构建了野生型和突变型TNF-α原核表达载体,并得到了高纯度的重组蛋白。用质谱法分析了突变体重组蛋白的分子量为16.7kDα。CCK-8法和流式细胞术检测了野生型和突变型TNF-α重组蛋白对L929细胞的细胞毒活性,证明突变型蛋白对肿瘤细胞的细胞毒活性明显增强。我们又用酶标法检测了两种重组蛋白刺激L02细胞分泌LDH的情况,证明了突变体蛋白的毒副作用有所降低。最后我们对两种重组蛋白进行了溶血性分析,突变型蛋白和野生型蛋白相比溶血性没有明显的增强。通过本实验,我们构建出了一种活性明显...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一部分 文献综述
    第1章 肿瘤坏死因子(TNF-α)研究进展
        1.1 肿瘤坏死因子(TNF-α)的生理生化性质
        1.2 肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达分布
        1.3 肿瘤坏死因子(TNF-α)受体及其信号通路
            1.3.1 TNFR1信号通路
            1.3.2 TNFR2信号通路
        1.4 肿瘤坏死因子(TNF-α)的生物学功能
            1.4.1 细胞毒活性
            1.4.2 宿主防御功能
            1.4.3 恶液质效应
            1.4.4 激活内皮细胞
            1.4.5 促使B细胞增殖及免疫球蛋白的产生
            1.4.6 T细胞胸腺细胞活化作用
            1.4.7 自然杀伤细胞的激活作用
            1.4.8 脂肪细胞的分化
            1.4.9 TNF-α与心脏疾病
            1.4.10 TNF-α在卵巢中的作用
        1.5 肿瘤坏死因子(TNF-α)抗肿瘤作用机制
            1.5.1 与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡
            1.5.2 作用肿瘤血管内皮细胞,使肿瘤血管功能紊乱
            1.5.3 增强宿主的免疫功能
        1.6 结语与展望
    第2章 肿瘤坏死因子(TNF-α)突变体研究进展
        2.1 TNF-α活性部位
        2.2 TNF-α突变体研究
        2.3 结语与展望
    第3章 中国家猪养殖现状简介
第二部分 实验部分
    第4章 家猪TNF-α突变体基因的构建、表达及活性鉴定
        4.1 实验材料
            4.1.1 实验动物、细胞、质粒和宿主菌
            4.1.2 试剂和耗材
            4.1.3 实验仪器
        4.2 实验方法
            4.2.1 家猪TNF-α基因的克隆
            4.2.2 家猪TNF-α野生型表达基因及突变体表达基因的获得
            4.2.3 重组表达载体pET28a-PmTNF-α及pET28α-PwTNF-α的构建
            4.2.4 重组蛋白体外表达
            4.2.5 重组蛋白纯化及Western blot鉴定
            4.2.6 质谱分析重组突变体蛋白分子量
            4.2.7 抗肿瘤细胞活性鉴定
            4.2.8 酶标法检测TNF-α对L02细胞毒副作用
            4.2.9 溶血性分析
        4.3 实验结果与分析
            4.3.1 家猪TNF-α基因获得
            4.3.2 家猪TNF-α野生型表达基因及突变体表达基因的获得
            4.3.3 重组表达载体pET28α-PmTNF-α及pET28a-PwTNF-α的构建
            4.3.4 重组蛋白的表达与纯化
            4.3.5 质谱分析重组突变体蛋白分子量
            4.3.6 CCK-8法分析重组家猪TNF-α蛋白对L929细胞毒活性
            4.3.7 流式细胞技术分析重组家猪TNF-α蛋白对L929细胞毒活性
            4.3.8 酶标法分析重组家猪TNF-α蛋白对L02细胞的毒副作用
            4.3.9 溶血性分析
        4.4 讨论
全文总结
参考文献
附录: 硕士在读期间研究成果
致谢



本文编号：3832907