猪链球菌2型SsPepO和SsPspC致病性及△SsPepO/△SsPspC缺失突变株免疫效力研究

发布时间：2023-07-25 02:52

　　猪链球菌(Streptococcus suis, suis)是引起猪链球菌病的主要病原菌,给世界养殖业造成巨大的损失,其中血清型2型作为一种重要人畜共患病原菌,还严重威胁着人类健康。目前,猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, S.suis 2)被认为是越南第一大,台湾第二大,泰国第三大致成人细菌性脑膜炎的主要病原菌。尽管猪链球菌2型在全球已收引起高度关注,国内外很多学者发掘鉴定了S. suis 2多种毒力因子,对致病机理也进行了一定程度的研究,但目前对S. suis 2致病与免疫机制仍然没有完全阐明清楚,主要原因可能是仍然还有许多未经鉴定的新毒力因子在其中发挥重要作用。因此,发掘、鉴定新的毒力因子,阐明其致病与免疫机制,将为进一步研制出安全、高效的疫苗奠定基础,从而最终有效的控制猪链球菌2型病在我国发生和流行。猪链球菌2型能逃避宿主天然免疫杀伤,并刺激机体产生炎症风暴,最终引起败血症、脑膜炎及中毒性休克综合征等典型症状。寻找并解释能诱导机体产生急性炎症的基因或蛋白将是解释S.suis 2诱发中毒性休克综合症的分子基础。本课题组在前期通过构建双组份调...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词(Abbreviation)
第1章 文献综述
    1.1 猪链球病的概述
        1.1.1 流行病学
        1.1.2 病原学
        1.1.3 猪链球菌2型病致病机制
        1.1.4 临床症状及病理变化
        1.1.5 诊断
        1.1.6 防治
    1.2 猪链球菌2型新型毒力因子
        1.2.1 双组份调控系统
        1.2.2 Rgg转录调控因子
        1.2.3 分解代谢控制蛋白A(CcpA)
        1.2.4 自溶素Atl
        1.2.5 胶原1型结合蛋白cbp40
        1.2.6 丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)
        1.2.7 金属绑定脂蛋白TroA
        1.2.8 毒力相关基因virA
        1.2.9 H因子结合表面蛋白HP0272(Fhb)
        1.2.10 调节因子PerR
    1.3 猪链球菌2型疫苗的研究进展
        1.3.1 灭活苗
        1.3.2 基因工程活载体疫苗
        1.3.3 活菌苗
第2章 研究的目的和意义
第3章 材料与方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌株、质粒及培养条件
        3.1.2 主要药品、试剂及仪器
        3.1.3 培养基与抗生素及其配制
        3.1.4 缓冲液
        3.1.5 引物
        3.1.6 实验动物
    3.2 实验方法
        3.2.1 猪链球菌2型的复苏
        3.2.2 猪链球菌2型基因组的提取
        3.2.3 PCR扩增
        3.2.4 PCR或酶切产物的回收与纯化
        3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
        3.2.6 连接产物的转化
        3.2.7 质粒的小量制备(改良的碱裂解法)
        3.2.8 质粒的大量制备(碱裂解法)
        3.2.9 重组质粒的鉴定
        3.2.10 猪链球菌2型的电转化
        3.2.11 基因缺失突变株的筛选
        3.2.12 基因缺失突变株RNA的提取
        3.2.13 基因缺失突变株的生物学特性研究
        3.2.14 基因缺失突变株对小鼠致病力分析
        3.2.15 基因缺失突变株感染小鼠后炎症因子的检测
        3.2.16 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC对小鼠的免疫效力试验
        3.2.17 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC对仔猪的安全性及免疫效力试验
        3.2.18 数据分析
第4章 结果与分析
    4.1 SsPepO与SsPspC基因生物信息学相关分析
    4.2 温敏型自杀性重组质粒pSET4s-△SsPspC的构建与鉴定
    4.3 基因缺失突变株的筛选和鉴定
        4.3.1 单基因缺失突变株△SsPspC的筛选与鉴定
        4.3.2 单基因缺失突变株△SsPepO的鉴定
        4.3.3 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC的筛选与鉴定
    4.4 基因缺失突变株生物学特性及致病性研究
        4.4.1 基因缺失突变株遗传稳定性分析
        4.4.2 基因缺失突变株生长特性研究
        4.4.3 基因缺失突变株溶血活性研究
        4.4.4 基因缺失突变株透射电镜观察
        4.4.5 基因缺失突变株突变株半数致死量(LD₅₀)的测定
        4.4.6 基因缺失突变株对Balb/c小鼠发病率及存活率试验
        4.4.7 基因缺失突变株感染组织载菌量测定
        4.4.8 基因缺失突变株感染小鼠后炎症因子的检测
        4.4.9 组织病理学分析
    4.5 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC对小鼠的免疫效力试验
        4.5.1 小鼠抗体水平评价
        4.5.2 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC诱导小鼠抗体IgG亚类分析
        4.5.3 淋巴细胞增殖试验
        4.5.4 细胞因子的测定
        4.5.5 全血杀菌试验
        4.5.6 攻毒保护试验
        4.5.7 被动免疫保护试验
        4.5.8 组织病理学分析
    4.6 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC对仔猪的免疫效力试验
        4.6.1 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC对仔猪的安全性试验
        4.6.2 免疫仔猪抗体水平检测
        4.6.3 双基因缺失突变株△SsPepO/△SsPspC诱导仔猪抗体IgG亚类分析
        4.6.4 全血杀菌试验
        4.6.5 免疫攻毒后的保护效果
        4.6.6 免疫保护效力评价
        4.6.7 组织病理学分析
第5章 讨论
    5.1 目的基因SsPepO和SsPspC的选择
    5.2 选择温敏型自杀性重组质粒构建基因缺失突变株的策略
    5.3 MCP-1、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子选择及结果分析
    5.4 以Balb/c小鼠为模型探讨SsPepO和SsPspC致病机制的依据及缺陷
    5.5 双基因缺失突株△SsPepO/△SsPspC免疫机制的初步探讨
第6章 结论
参考文献
致谢
附录



本文编号：3837023