柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4互作蛋白的筛选与验证
发布时间：2023-08-01 17:34
钙离子是生物体内信号转导的第二信使,在顶复器原虫钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)作为钙离子的重要下游信号分子在生物体调控自身代谢及其对外界环境的适应过程中发挥着重要的功能。实验室前期对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)CDPK4(EtCDPK4)功能进行了初步研究,发现该蛋白翻译水平在裂殖子阶段高表达,且与子孢子入侵宿主细胞相关。为了解EtCDPK4在虫体入侵及发育过程中是如何发挥作用的,本文筛选了EtCDPK4的互作蛋白,对其中两个可能与EtCDPK4相互作用的蛋白进行了验证。1.EtCDPK4互作蛋白的筛选提取柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA,经PolyA Ttract?mRNA Isolation Systems III分离mRNA,利用MMLV-RT反转录合成cDNA第一链。LD-PCR合成双链cDNA(dscDNAs)后经纯化柱纯化去除200 bp以下dscDNAs。纯化后的dscDNAs与pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母感受态细胞,经SD/-Leu缺陷型培养基培养...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第1章 文献综述
1.1 顶复器门原虫Ca2+稳态和储存
1.2 顶复器原虫Ca2+传导与功能
1.3 顶复器原虫Ca2+结合蛋白
1.4 Ca2+功能
1.5 CDPK功能
第2章 柔嫩艾美耳球虫CDPK4互作蛋白的筛选
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验动物与虫株
2.2.2 实验试剂及仪器
2.2.3 实验所需试剂配制方法
2.2.4 柔嫩艾美耳球虫裂殖子的收集与纯化
2.2.5 柔嫩艾美耳球虫裂殖子总RNA提取
2.2.6 柔嫩艾美耳球虫裂殖子mRNA分离
2.2.7 柔嫩艾美耳球虫裂殖子dscDNA合成与纯化
2.2.8 酵母感受态细胞的制备
2.2.9 柔嫩艾美耳球虫裂殖子Y2HcDNA文库的构建
2.2.10 柔嫩艾美耳球虫裂殖子cDNA文库检测
2.2.11 pGBKT7-EtCDPK4质粒复苏及提取
2.2.12 Y2H筛选EtCDPK4互作蛋白
2.2.13 回复杂交验证阳性质粒
2.3 结果
2.3.1 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的收集与纯化
2.3.2 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA提取
2.3.3 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子mRNA分离及双链cDNA纯化
2.3.4 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母cDNA文库构建和质量检测
2.3.5 Y2H初步筛选EtCDPK4互作蛋白
2.3.6 回复杂交验证
2.4 讨论
第3章 柔嫩艾美耳球虫CDPK4两个互作蛋白的验证
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验动物、虫株、细胞和质粒
3.2.2 实验试剂及仪器
3.2.3 实验所用试剂配制方法
3.2.4 柔嫩艾美耳球虫裂殖子、子孢子收集与纯化
3.2.5 EtSerpin、EtRPAC1及EtCDPK4基因克隆
3.2.6 DF-1细胞复苏与培养
3.2.7 双分子荧光互补(BiFC)实验
3.2.8 免疫共沉淀(Co-IP)实验
3.2.9 EtSerpin与EtCDPK4共定位
3.3 结果
3.3.1 真核重组质粒pBiFC-VC155-EtCDPK4、pBiFC-VN155-EtSerpin、pBiFC-VN155-EtRPAC1构建
3.3.2 真核重组质粒pcDNA3.1-flag-EtCDPK4、pcDNA3.1-flag-EtRPAC1构建
3.3.3 BiFC验证蛋白互作
3.3.4 Co-IP验证蛋白互作
3.3.5 EtSerpin与EtCDPK4共定位
3.4 讨论
第4章 柔嫩艾美耳球虫RPAC1功能初步分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验动物
4.2.2 虫株、载体和细胞
4.2.3 实验试剂及仪器
4.2.4 基因的克隆与序列分析
4.2.5 重组表达质粒的构建
4.2.6 融合蛋白的表达与分析
4.2.7 融合蛋白的纯化
4.2.8 融合蛋白多克隆抗体的制备与纯化
4.2.9 蛋白免疫原性和反应原性检测分析
4.2.10 抗rEtRPAC1多克隆抗体体外抑制分析
4.3 结果
4.3.1 EtRPAC1基因生物信息学分析
4.3.2 原核重组表达质粒的构建
4.3.3 重组蛋白的诱导表达及表达形式分析
4.3.4 重组蛋白的纯化
4.3.5 多克隆抗体的制备与纯化
4.3.6 重组蛋白免疫原性及反应原性分析
4.3.7 体外抑制实验
4.4 讨论
第5章 全文总结
参考文献
作者简介
致谢
本文编号：3838043
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第1章 文献综述
1.1 顶复器门原虫Ca2+稳态和储存
1.2 顶复器原虫Ca2+传导与功能
1.3 顶复器原虫Ca2+结合蛋白
1.4 Ca2+功能
1.5 CDPK功能
第2章 柔嫩艾美耳球虫CDPK4互作蛋白的筛选
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验动物与虫株
2.2.2 实验试剂及仪器
2.2.3 实验所需试剂配制方法
2.2.4 柔嫩艾美耳球虫裂殖子的收集与纯化
2.2.5 柔嫩艾美耳球虫裂殖子总RNA提取
2.2.6 柔嫩艾美耳球虫裂殖子mRNA分离
2.2.7 柔嫩艾美耳球虫裂殖子dscDNA合成与纯化
2.2.8 酵母感受态细胞的制备
2.2.9 柔嫩艾美耳球虫裂殖子Y2HcDNA文库的构建
2.2.10 柔嫩艾美耳球虫裂殖子cDNA文库检测
2.2.11 pGBKT7-EtCDPK4质粒复苏及提取
2.2.12 Y2H筛选EtCDPK4互作蛋白
2.2.13 回复杂交验证阳性质粒
2.3 结果
2.3.1 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的收集与纯化
2.3.2 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA提取
2.3.3 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子mRNA分离及双链cDNA纯化
2.3.4 柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子酵母cDNA文库构建和质量检测
2.3.5 Y2H初步筛选EtCDPK4互作蛋白
2.3.6 回复杂交验证
2.4 讨论
第3章 柔嫩艾美耳球虫CDPK4两个互作蛋白的验证
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验动物、虫株、细胞和质粒
3.2.2 实验试剂及仪器
3.2.3 实验所用试剂配制方法
3.2.4 柔嫩艾美耳球虫裂殖子、子孢子收集与纯化
3.2.5 EtSerpin、EtRPAC1及EtCDPK4基因克隆
3.2.6 DF-1细胞复苏与培养
3.2.7 双分子荧光互补(BiFC)实验
3.2.8 免疫共沉淀(Co-IP)实验
3.2.9 EtSerpin与EtCDPK4共定位
3.3 结果
3.3.1 真核重组质粒pBiFC-VC155-EtCDPK4、pBiFC-VN155-EtSerpin、pBiFC-VN155-EtRPAC1构建
3.3.2 真核重组质粒pcDNA3.1-flag-EtCDPK4、pcDNA3.1-flag-EtRPAC1构建
3.3.3 BiFC验证蛋白互作
3.3.4 Co-IP验证蛋白互作
3.3.5 EtSerpin与EtCDPK4共定位
3.4 讨论
第4章 柔嫩艾美耳球虫RPAC1功能初步分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验动物
4.2.2 虫株、载体和细胞
4.2.3 实验试剂及仪器
4.2.4 基因的克隆与序列分析
4.2.5 重组表达质粒的构建
4.2.6 融合蛋白的表达与分析
4.2.7 融合蛋白的纯化
4.2.8 融合蛋白多克隆抗体的制备与纯化
4.2.9 蛋白免疫原性和反应原性检测分析
4.2.10 抗rEtRPAC1多克隆抗体体外抑制分析
4.3 结果
4.3.1 EtRPAC1基因生物信息学分析
4.3.2 原核重组表达质粒的构建
4.3.3 重组蛋白的诱导表达及表达形式分析
4.3.4 重组蛋白的纯化
4.3.5 多克隆抗体的制备与纯化
4.3.6 重组蛋白免疫原性及反应原性分析
4.3.7 体外抑制实验
4.4 讨论
第5章 全文总结
参考文献
作者简介
致谢
本文编号：3838043
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3838043.html
最近更新
教材专著
