猪诱导型多能干细胞多能性维持的机理研究
发布时间：2023-08-16 17:06
诱导多能干细胞技术主要涉及两个方面,一方面是利用外源特定转录因子导入受体细胞,激活受体细胞的内源基因表达,改变相关的表观遗传印记,使细胞处于一种不稳定的中间活化状态；另一方面是通过特定的培养条件,将处于中间活化状态的细胞向特定方向进行诱导和筛选,根据所提供的多能干细胞特定培养条件,筛选出与胚胎干细胞相类似的诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。 目前猪诱导型多能干细胞(piPSCs)不同细胞系之间差异较大,特征难以统一,所得到的大部分piPSCs细胞系均未能实现外源基因的沉默,虽然有报道piPSCs可以进行嵌合体实验,至今却没有得到其他实验室的重复,更令人奇怪的是piPSCs的核移植胚胎发育率远远低于正常的体细胞,并且克隆胚胎的体内发育率更是极低,不能达到小鼠iPSCs细胞的多能性水平,这也使piPSCs细胞在转基因猪生产和建立疾病模型方面的应用受到限制。此外,猪胚胎干细胞的研究进展缓慢,没有公认的猪胚胎干细胞及合适的培养系统作为参考,且猪发育生物学上研究的不充分,使得piPSCs在体外的多能性维持较为困难。 基于诱导多能干细胞...
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 哺乳动物多能性干细胞研究概况
1.2 诱导多能性干细胞技术的研究进展
1.2.1 核移植技术
1.2.2 诱导多能性干细胞技术
1.3 小鼠诱导型多能干细胞
1.4 人诱导型多能干细胞
1.5 猪诱导型多能干细胞
1.6 不同实验室诱导的猪多能干细胞比较
1.7 猪诱导型多能干细胞存在的问题
1.8 本研究在猪遗传育种中的重要意义
1.8.1 猪ESC建立
1.8.2 转基因猪生产
1.8.3 猪遗传资源保存与利用
第二章 两种来源piPSCs产生效率和体外增殖能力的影响因素研究
2.1 材料与方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 药品与试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.1.4 巴马小型猪耳缘组织成纤维细胞培养
2.1.5 巴马小型猪骨髓间充质干细胞分离培养
2.1.6 慢病毒包装和滴度测定
2.1.7 慢病毒诱导巴马小型猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源多能性干细胞
2.1.8 巴马小型猪iPSCs鉴定
2.1.9 不同饲养层对巴马小型猪iPSCs体外增殖能力的影响
2.1.10 传代方式对巴马小型猪iPSCs增殖能力的影响
2.1.11 ROCK抑制剂对巴马小型猪iPSCs冻存复苏率的影响
2.1.12 细胞周期蛋白对巴马小型猪iPSCs增殖的影响
2.1.13 克隆形成率计算
2.1.14 克隆倍增时间的计算
2.1.15 数据分析
2.2 结果
2.2.1 巴马小型猪耳缘组织成纤维细胞和骨髓间充质干细胞分离培养
2.2.2 多能性基因比对分析及其慢病毒载体鉴定
2.2.3 慢病毒的包装及滴度测定
2.2.4 慢病毒感染复数的确定
2.2.5 慢病毒诱导巴马小型猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源多能性干细胞
2.2.6 猪成纤维细胞和骨髓间充质干细胞诱导多能干细胞的形态学观察
2.2.7 碱性磷酸酶活性检测
2.2.8 干细胞表面标记的免疫荧光检测
2.2.9 干细胞内外源基因的表达分析
2.2.10 核型分析
2.2.11 类胚体形成实验
2.2.12 巴马小型猪iPSCs体外分化能力检测
2.2.13 巴马小型猪iPSCs畸胎瘤形成实验
2.2.14 不同饲养层对猪诱导型多能干细胞体外增殖能力的影响
2.2.15 传代方式对猪诱导型多能性干细胞增殖能力的影响
2.2.16 ROCK抑制剂对猪诱导型多能性干细胞复苏率的影响
2.2.17 细胞周期蛋白对猪诱导型多能性干细胞增殖的影响
2.3 讨论
第三章 两种状态piPSCs的生物学特性和分子调控机制研究
3.1 材料
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 试剂的配制
3.1.4 主要仪器及耗材
3.2 试验方法
3.2.1 piPB4-6细胞的培养
3.2.2 小鼠ES细胞样猪iPS细胞的获得及培养
3.2.3 单位面积克隆数的统计
3.2.4 细胞活性分析
3.2.5 单克隆形成率
3.2.6 piPB4-6m细胞的鉴定分析
3.2.7 X染色体状态的检测
3.2.8 piPB4-6h和piPB4-6m细胞信号通路相关基因表达模式
3.2.9 piPB4-6h和piPB4-6m的DLK-DIO3印记区间检测
3.2.10 数据统计
3.3 结果
3.3.1 小鼠ES细胞样猪iPSCs的培养
3.3.2 单位面积克隆数的统计
3.3.3 细胞活性分析
3.3.4 单细胞克隆形成率
3.3.5 piPB4-6m细胞的鉴定分析
3.3.7 piPB4-6m和piPB4-6h X染色体状态的检测
3.3.8 piPB4-6m和piPB4-6h细胞信号通路相关基因表达模式
3.3.9 piPB4-6m和piPB4-6h的DLK-D103印记区间检测
3.4. 讨论
结论
参考文献
致谢
博士、博士后期间发表论文
个人简介
本文编号：3842325
【文章页数】：107 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 哺乳动物多能性干细胞研究概况
1.2 诱导多能性干细胞技术的研究进展
1.2.1 核移植技术
1.2.2 诱导多能性干细胞技术
1.3 小鼠诱导型多能干细胞
1.4 人诱导型多能干细胞
1.5 猪诱导型多能干细胞
1.6 不同实验室诱导的猪多能干细胞比较
1.7 猪诱导型多能干细胞存在的问题
1.8 本研究在猪遗传育种中的重要意义
1.8.1 猪ESC建立
1.8.2 转基因猪生产
1.8.3 猪遗传资源保存与利用
第二章 两种来源piPSCs产生效率和体外增殖能力的影响因素研究
2.1 材料与方法
2.1.1 实验动物
2.1.2 药品与试剂
2.1.3 主要实验仪器
2.1.4 巴马小型猪耳缘组织成纤维细胞培养
2.1.5 巴马小型猪骨髓间充质干细胞分离培养
2.1.6 慢病毒包装和滴度测定
2.1.7 慢病毒诱导巴马小型猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源多能性干细胞
2.1.8 巴马小型猪iPSCs鉴定
2.1.9 不同饲养层对巴马小型猪iPSCs体外增殖能力的影响
2.1.10 传代方式对巴马小型猪iPSCs增殖能力的影响
2.1.11 ROCK抑制剂对巴马小型猪iPSCs冻存复苏率的影响
2.1.12 细胞周期蛋白对巴马小型猪iPSCs增殖的影响
2.1.13 克隆形成率计算
2.1.14 克隆倍增时间的计算
2.1.15 数据分析
2.2 结果
2.2.1 巴马小型猪耳缘组织成纤维细胞和骨髓间充质干细胞分离培养
2.2.2 多能性基因比对分析及其慢病毒载体鉴定
2.2.3 慢病毒的包装及滴度测定
2.2.4 慢病毒感染复数的确定
2.2.5 慢病毒诱导巴马小型猪成纤维细胞/骨髓间充质干细胞来源多能性干细胞
2.2.6 猪成纤维细胞和骨髓间充质干细胞诱导多能干细胞的形态学观察
2.2.7 碱性磷酸酶活性检测
2.2.8 干细胞表面标记的免疫荧光检测
2.2.9 干细胞内外源基因的表达分析
2.2.10 核型分析
2.2.11 类胚体形成实验
2.2.12 巴马小型猪iPSCs体外分化能力检测
2.2.13 巴马小型猪iPSCs畸胎瘤形成实验
2.2.14 不同饲养层对猪诱导型多能干细胞体外增殖能力的影响
2.2.15 传代方式对猪诱导型多能性干细胞增殖能力的影响
2.2.16 ROCK抑制剂对猪诱导型多能性干细胞复苏率的影响
2.2.17 细胞周期蛋白对猪诱导型多能性干细胞增殖的影响
2.3 讨论
第三章 两种状态piPSCs的生物学特性和分子调控机制研究
3.1 材料
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 试剂的配制
3.1.4 主要仪器及耗材
3.2 试验方法
3.2.1 piPB4-6细胞的培养
3.2.2 小鼠ES细胞样猪iPS细胞的获得及培养
3.2.3 单位面积克隆数的统计
3.2.4 细胞活性分析
3.2.5 单克隆形成率
3.2.6 piPB4-6m细胞的鉴定分析
3.2.7 X染色体状态的检测
3.2.8 piPB4-6h和piPB4-6m细胞信号通路相关基因表达模式
3.2.9 piPB4-6h和piPB4-6m的DLK-DIO3印记区间检测
3.2.10 数据统计
3.3 结果
3.3.1 小鼠ES细胞样猪iPSCs的培养
3.3.2 单位面积克隆数的统计
3.3.3 细胞活性分析
3.3.4 单细胞克隆形成率
3.3.5 piPB4-6m细胞的鉴定分析
3.3.7 piPB4-6m和piPB4-6h X染色体状态的检测
3.3.8 piPB4-6m和piPB4-6h细胞信号通路相关基因表达模式
3.3.9 piPB4-6m和piPB4-6h的DLK-D103印记区间检测
3.4. 讨论
结论
参考文献
致谢
博士、博士后期间发表论文
个人简介
本文编号：3842325
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