碳酸酐酶4基因对鸡成纤维细胞培养液酸碱环境的影响
发布时间：2023-08-29 20:15
碳酸酐酶4(Carbonic Anhydrase 4,CA4)是碳酸酐酶家族成员之一,催化二氧化碳与水反应生成碳酸氢根与氢离子的可逆反应,主要影响细胞环境中的pH值。目前,基于CA4的研究主要集中在肺、骨骼肌和癌症中,对生殖发育方面的研究较少。研究表明,CA4在鸡贮精腺上皮细胞中有表达,并且在子宫阴道交接部表达量高,提示CA4对雌性家禽贮精腺酸碱环境具有调控作用。本研究以鸡胚成纤维细胞(DF-1)为模型,利用RNAi方法,通过细胞培养、免疫荧光、免疫组化、qRT-PCR等技术研究CA4对DF-1细胞培养液pH和左旋乳酸的作用。主要研究结果如下:(1)筛查鸡CA4基因外显子区段上存在的SNP位点,发现6个SNP位点,其中有4个SNP的密码子变化引起了氨基酸的变化。第620位碱基发生C/T突变,该位点突变引起脯氨酸突变为亮氨酸,第721位碱基发生T/A突变,该位点突变使色氨酸突变为精氨酸,第796位碱基发生A/T突变,该位点突变导致编码的赖氨酸突变为终止密码子,第847位碱基发生G/T突变,该位点突变导致编码的甘氨酸突变为半胱氨酸。(2)CA4和MCT4基因均在DF-1细胞表达,定位于细胞...
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词表(ABBREVIATIONS)
1 前言
1.1 家禽贮精腺研究进展
1.1.1 家禽贮精腺组织结构
1.1.2 家禽贮精腺分泌物以及其作用
1.2 CA4基因研究进展
1.2.1 CA4基因和蛋白结构
1.2.2 CA4基因的表达与定位
1.2.3 CA4与精子活力
1.2.4 CA4与家禽贮精能力有关
1.2.5 CA4与单羧酸转运体的协同作用
1.3 MCT4基因研究进展
1.3.1 MCT4基因和蛋白结构
1.3.2 MCT4基因的表达与功能
1.4 实验的目的和意义
2 实验材料
2.1 实验细胞与DNA
2.2 抗体
2.3 实验仪器
2.4 实验试剂与耗材
2.5 实验试剂的配制
3 实验方法
3.1 鸡CA4基因的序列分析
3.1.1 鸡CA4基因的PCR扩增
3.1.2 CA4基因PCR扩增产物的电泳检测
3.2 设计并合成siRNA
3.3 DF-1细胞的培养
3.3.1 细胞培养
3.3.2 细胞传代
3.3.3 细胞冻存与复苏
3.4 鸡DF-1细胞CA4基因mRNA表达的检测
3.4.1 DF-1细胞RNA提取
3.4.2 cDNA链反转录合成
3.4.3 荧光引物设计
3.4.4 qRT-PCR
3.5 DF-1细胞CA4蛋白表达的检测
3.5.1 CA4的细胞免疫化学
3.5.2 CA4细胞免疫荧光
3.5.3 DF-1细胞内CA4的表达
3.6 DF-1细胞中MCT4基因mRNA表达的检测
3.6.1 DF-1细胞RNA提取
3.6.2 cDNA链反转录合成
3.6.3 荧光引物设计
3.6.4 qRT-PCR
3.7 DF-1细胞上MCT4蛋白表达的检测
3.8 siRNA的转染
3.9 培养液pH值检测
3.10 左旋乳酸含量检测
3.11 数据分析
4 实验结果
4.1 鸡CA4基因序列分析
4.1.1 CA4基因PCR扩增产物的电泳检测
4.1.2 CA4基因测序结果
4.2 CA4基因在DF-1细胞中的表达
4.2.1 DF-1细胞CA4蛋白的表达
4.2.2 DF-1细胞CA4基因mRNA的表达
4.3 RNAi干扰DF-1细胞对CA4表达的影响
4.3.1 RNAi对DF-1细胞CA4mRNA水平的影响
4.3.2 RNAi对DF-1细胞CA4蛋白水平的影响
4.3.3 RNAi对DF-1细胞培养液CA4蛋白水平的影响
4.4 MCT4在DF-1细胞上的表达
4.4.1 DF-1细胞MCT4蛋白的表达
4.4.2 DF-1细胞MCT4基因mRNA的表达
4.4.3 CA4基因干扰对DF-1细胞MCT4基因表达的影响
4.4.4 CA4基因干扰对DF-1细胞MCT4蛋白水平的影响
4.5 CA4基因干扰对DF-1细胞培养液pH值的影响
4.6 CA4基因干扰对DF-1细胞培养液左旋乳酸含量的影响
5 讨论
5.1 鸡CA4基因序列分析
5.2 CA4在DF-1细胞上的表达
5.3 CA4基因干扰与DF-1细胞培养液的pH值
5.4 MCT4基因在DF-1细胞上表达
5.5 鸡CA4基因影响DF-1细胞培养液中左旋乳酸的含量
5.6 鸡CA4可能有利于禽类贮精腺的精子贮存
6 全文结论
7 进一步研究的建议
参考文献
致谢
本文编号：3844210
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
中英文缩略词表(ABBREVIATIONS)
1 前言
1.1 家禽贮精腺研究进展
1.1.1 家禽贮精腺组织结构
1.1.2 家禽贮精腺分泌物以及其作用
1.2 CA4基因研究进展
1.2.1 CA4基因和蛋白结构
1.2.2 CA4基因的表达与定位
1.2.3 CA4与精子活力
1.2.4 CA4与家禽贮精能力有关
1.2.5 CA4与单羧酸转运体的协同作用
1.3 MCT4基因研究进展
1.3.1 MCT4基因和蛋白结构
1.3.2 MCT4基因的表达与功能
1.4 实验的目的和意义
2 实验材料
2.1 实验细胞与DNA
2.2 抗体
2.3 实验仪器
2.4 实验试剂与耗材
2.5 实验试剂的配制
3 实验方法
3.1 鸡CA4基因的序列分析
3.1.1 鸡CA4基因的PCR扩增
3.1.2 CA4基因PCR扩增产物的电泳检测
3.2 设计并合成siRNA
3.3 DF-1细胞的培养
3.3.1 细胞培养
3.3.2 细胞传代
3.3.3 细胞冻存与复苏
3.4 鸡DF-1细胞CA4基因mRNA表达的检测
3.4.1 DF-1细胞RNA提取
3.4.2 cDNA链反转录合成
3.4.3 荧光引物设计
3.4.4 qRT-PCR
3.5 DF-1细胞CA4蛋白表达的检测
3.5.1 CA4的细胞免疫化学
3.5.2 CA4细胞免疫荧光
3.5.3 DF-1细胞内CA4的表达
3.6 DF-1细胞中MCT4基因mRNA表达的检测
3.6.1 DF-1细胞RNA提取
3.6.2 cDNA链反转录合成
3.6.3 荧光引物设计
3.6.4 qRT-PCR
3.7 DF-1细胞上MCT4蛋白表达的检测
3.8 siRNA的转染
3.9 培养液pH值检测
3.10 左旋乳酸含量检测
3.11 数据分析
4 实验结果
4.1 鸡CA4基因序列分析
4.1.1 CA4基因PCR扩增产物的电泳检测
4.1.2 CA4基因测序结果
4.2 CA4基因在DF-1细胞中的表达
4.2.1 DF-1细胞CA4蛋白的表达
4.2.2 DF-1细胞CA4基因mRNA的表达
4.3 RNAi干扰DF-1细胞对CA4表达的影响
4.3.1 RNAi对DF-1细胞CA4mRNA水平的影响
4.3.2 RNAi对DF-1细胞CA4蛋白水平的影响
4.3.3 RNAi对DF-1细胞培养液CA4蛋白水平的影响
4.4 MCT4在DF-1细胞上的表达
4.4.1 DF-1细胞MCT4蛋白的表达
4.4.2 DF-1细胞MCT4基因mRNA的表达
4.4.3 CA4基因干扰对DF-1细胞MCT4基因表达的影响
4.4.4 CA4基因干扰对DF-1细胞MCT4蛋白水平的影响
4.5 CA4基因干扰对DF-1细胞培养液pH值的影响
4.6 CA4基因干扰对DF-1细胞培养液左旋乳酸含量的影响
5 讨论
5.1 鸡CA4基因序列分析
5.2 CA4在DF-1细胞上的表达
5.3 CA4基因干扰与DF-1细胞培养液的pH值
5.4 MCT4基因在DF-1细胞上表达
5.5 鸡CA4基因影响DF-1细胞培养液中左旋乳酸的含量
5.6 鸡CA4可能有利于禽类贮精腺的精子贮存
6 全文结论
7 进一步研究的建议
参考文献
致谢
本文编号：3844210
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3844210.html
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