河南部分地区NDV分子流行病学研究及NDV HN主要抗原区蛋白在抗体检测中的应用
发布时间：2023-10-30 17:39
新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的具有高度传染性的家禽传染病，给世界各国的养禽业带来严重的经济损失。随着NDV疫苗的广泛应用，ND的流行虽得到控制，但是其流行趋势却在发生变化，如非典型性ND、病毒新基因型出现和致病性宿主范围扩大等给临床ND的防控来带很大困难。HN蛋白是位于NDV囊膜表面的一种主要结构蛋白、病毒保护性抗原之一，它在抗原性的决定等方面具有重要作用。本研究在分析河南部分地区NDV分子流行病学的基础上，利用原核表达系统获得了新乡地区致病株ND xx08株HN主要抗原区重组蛋白，利用纯化的重组HN蛋白建立检测ND抗体的间接ELISA方法。 通过鸡胚接种病毒收获尿囊液，血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验检测其血凝活性，利用RT-PCR技术扩增NDV F蛋白裂解位点处重要功能区基因片段，同时进行序列测定，构建NDV遗传进化树，分析其遗传关系。结果显示从发病死亡鸡体内分离到6株具有血凝活性的NDV，遗传进化分析表明：6株NDV分离株均属ClassⅡ、基因Ⅶ型，F蛋白裂解位点处氨基酸序列为...
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
缩略词表
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 NDV 的分子流行病学研究进展
1.1 ND 的流行情况
1.2 我国 NDV 分子流行病学情况
2 NDV 分子生物学特性
2.1 NDV 的形态结构
2.2 NDV 的理化特性
2.3 NDV 的基因组结构特征
2.4 NDV 编码的主要结构蛋白
3 NDV 检测方法研究进展
3.1 血凝试验和血凝抑制试验
3.2 RT-PCR 技术
3.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）
3.4 血清中和实验（VN）
3.5 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICGT）
4 ND 的防控
第二章 河南省部分地区鸡源 NDV 分子流行病学特点
1 试验材料
1.1 病料
1.2 SPF 鸡胚及红细胞制备
1.3 酶及相关试剂
1.4 试验仪器
2 试验方法
2.1 病毒分离
2.2 病毒的血清学鉴定
2.3 病毒 RNA 提取
2.4 病毒 F 基因扩增
3 结果
3.1 血清学鉴定结果
3.2 RT-PCR 检测结果
3.3 分离株 F 基因遗传进化分析
3.4 分离株 F 基因及氨基酸序列分析
4 讨论
4.1 目前河南部分地区 NDV 毒株流行情况
4.2 现行疫苗对流行毒株的保护
4.3 NDV 分子流行病学监测的重要要性
5 小结
第三章 ND xx08 株 HN 基因主要抗原区的原核表达及鉴定
1 试验材料
1.1 病毒、菌种和质粒
1.2 酶及其他相关试剂
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂配制
1.5 SDS-PAGE 电泳缓冲液
1.6 Western-blott 所用溶液
1.7 蛋白纯化相关溶液
2 方法
2.1 引物设计与合成
2.2 病毒基因组 RNA 的提取
2.3 HN 主要抗原区基因片段的 PCR 扩增
2.4 PCR 产物的回收与纯化
2.5 NDV xx08 株 HN 基因片段与 pMD18-T-vector 克隆载体连接
2.6 HN 基因片段连接产物的转化
2.7 重组克隆质粒的鉴定
2.8 重组表达质粒 pET-28a-rHN
2.9 重组表达质粒在大肠杆菌中的表达
3 结果与分析
3.1 NDV xx08 株 HN 抗原区基因片段的获得
3.2 重组克隆质粒的构建及鉴定
3.3 NDV HN 抗原区基因片段的序列分析结果
3.4 重组表达质粒的构建
3.5 表达产物的分析及鉴定
3.6 表达产物的可溶性分析
3.7 目的蛋白的纯化
4 讨论
4.1 关于 NDV xx08 株 HN 主要抗原区基因片段
4.2 关于原核表达条件的优化
4.3 关于蛋白纯化
5 小结
第四章 NDV 抗体检测方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果与分析
2.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度的确定
2.2 酶标二抗工作浓度的确定
2.3 最佳血清反应时间的确定
2.4 最佳二抗反应时间的确定
2.5 间接 ELISA 临界值的判定
2.6 ELISA 方法特异性、敏感性和准确性试验
2.7 交叉反应实验结果
2.8 临床血清样品检测
3 讨论
4 小结
全文结论
参考文献
攻读学位期间发表的论文
附录
致谢
本文编号：3858892
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
目录
缩略词表
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 NDV 的分子流行病学研究进展
1.1 ND 的流行情况
1.2 我国 NDV 分子流行病学情况
2 NDV 分子生物学特性
2.1 NDV 的形态结构
2.2 NDV 的理化特性
2.3 NDV 的基因组结构特征
2.4 NDV 编码的主要结构蛋白
3 NDV 检测方法研究进展
3.1 血凝试验和血凝抑制试验
3.2 RT-PCR 技术
3.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）
3.4 血清中和实验（VN）
3.5 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICGT）
4 ND 的防控
第二章 河南省部分地区鸡源 NDV 分子流行病学特点
1 试验材料
1.1 病料
1.2 SPF 鸡胚及红细胞制备
1.3 酶及相关试剂
1.4 试验仪器
2 试验方法
2.1 病毒分离
2.2 病毒的血清学鉴定
2.3 病毒 RNA 提取
2.4 病毒 F 基因扩增
3 结果
3.1 血清学鉴定结果
3.2 RT-PCR 检测结果
3.3 分离株 F 基因遗传进化分析
3.4 分离株 F 基因及氨基酸序列分析
4 讨论
4.1 目前河南部分地区 NDV 毒株流行情况
4.2 现行疫苗对流行毒株的保护
4.3 NDV 分子流行病学监测的重要要性
5 小结
第三章 ND xx08 株 HN 基因主要抗原区的原核表达及鉴定
1 试验材料
1.1 病毒、菌种和质粒
1.2 酶及其他相关试剂
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂配制
1.5 SDS-PAGE 电泳缓冲液
1.6 Western-blott 所用溶液
1.7 蛋白纯化相关溶液
2 方法
2.1 引物设计与合成
2.2 病毒基因组 RNA 的提取
2.3 HN 主要抗原区基因片段的 PCR 扩增
2.4 PCR 产物的回收与纯化
2.5 NDV xx08 株 HN 基因片段与 pMD18-T-vector 克隆载体连接
2.6 HN 基因片段连接产物的转化
2.7 重组克隆质粒的鉴定
2.8 重组表达质粒 pET-28a-rHN
2.9 重组表达质粒在大肠杆菌中的表达
3 结果与分析
3.1 NDV xx08 株 HN 抗原区基因片段的获得
3.2 重组克隆质粒的构建及鉴定
3.3 NDV HN 抗原区基因片段的序列分析结果
3.4 重组表达质粒的构建
3.5 表达产物的分析及鉴定
3.6 表达产物的可溶性分析
3.7 目的蛋白的纯化
4 讨论
4.1 关于 NDV xx08 株 HN 主要抗原区基因片段
4.2 关于原核表达条件的优化
4.3 关于蛋白纯化
5 小结
第四章 NDV 抗体检测方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果与分析
2.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度的确定
2.2 酶标二抗工作浓度的确定
2.3 最佳血清反应时间的确定
2.4 最佳二抗反应时间的确定
2.5 间接 ELISA 临界值的判定
2.6 ELISA 方法特异性、敏感性和准确性试验
2.7 交叉反应实验结果
2.8 临床血清样品检测
3 讨论
4 小结
全文结论
参考文献
攻读学位期间发表的论文
附录
致谢
本文编号：3858892
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