猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR诊断方法及联合检测基因芯片诊断方法的建立

发布时间：2023-11-12 15:44

　　规模化猪群养殖密度的增大使得猪群之间接触频率增加,间接加快了疾病的传播速度。我国猪疫病混合感染的比例大幅度上升,繁殖障碍类疾病也多呈现混合感染。当前以猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)以及猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirusⅡ,PCV-2)引起的猪繁殖障碍类疾病为主要危害。因五种繁殖障碍性疾病具有相似的临床症状,增加了临床快速鉴别诊断的难度。目前,实验室常用的血清学诊断及病毒分离鉴定等方法存在着费时费力、敏感性低的缺陷,不能满足临床诊断的需求。基因芯片技术是集分子生物学技术、计算机技术及荧光标记技术于一体的新的基因检测方法,该方法具有快速、高特异性、高灵敏性、高通量、多样性等特点,现已被广泛应用于疾病诊断、药物筛选、多态性分析等多个领域。多重PCR可灵...

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
第一章 文献综述
    1 猪五种繁殖障碍性病毒病及其诊断技术的研究进展
        1.1 概述
            1.1.1 猪瘟的概述
            1.1.2 猪细小病毒的概述
            1.1.3 猪呼吸与繁殖综合征概述
            1.1.4 日本乙型脑炎概述
            1.1.5 猪圆环病毒2型概述
        1.2 五种病毒诊断技术的研究进展
            1.2.1 病毒的分离与鉴定
            1.2.2 血清学检测
                1.2.2.1 间接免疫荧光试验(IFA)
                1.2.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
                1.2.2.3 免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)
                1.2.2.4 病毒中和试验(SN)
            1.2.3 分子生物学技术
                1.2.3.1 聚合酶链式反应(PCR)
                1.2.3.2 环介导等温扩增技术(LAMP)
                1.2.3.3 原位杂交技术(ISH)
                1.2.3.4 基因芯片技术
    2 基因芯片技术及其在猪重大病毒性疾病研究中的应用
        2.1 基因芯片概述
            2.1.1 基因芯片技术的概念
            2.1.2 基因芯片技术的原理
            2.1.3 基因芯片的分类及常用技术比较
        2.2 基因芯片技术的操作流程
            2.2.1 基因芯片探针的设计及芯片方阵的构建
            2.2.2 基因芯片载体的选择
            2.2.3 基因芯片的制备方法
            2.2.4 样品的制备与标记
            2.2.5 芯片杂交与杂交后清洗
            2.2.6 信号检测与结果分析
        2.3 基因芯片技术在猪重大病毒性疾病研究中的应用
            2.3.1 基因芯片在病毒性疾病诊断中的应用
            2.3.2 利用基因芯片技术对病毒进行基因分型
            2.3.3 基因芯片在感染性疾病致病机制中的应用
            2.3.4 基因芯片在基因表达分析中的应用
        2.4 基因芯片技术存在的问题以及对未来的展望
    3 本研究的目的与意义
第二章 试验研究
    试验一CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2五种猪繁殖障碍性病毒病多重PCR诊断方法的建立
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 材料
                2.1.1 毒株及病料来源
                2.1.2 主要试剂
                2.1.3 主要仪器
            2.2 方法
                2.2.1 病毒基因组DNA的提取及检测
                    2.2.1.1 基因组DNA的提取
                2.2.2 RNA的提取、检测及反转录
                    2.2.2.1 RNA的提取
                    2.2.2.2 RNA的检测
                    2.2.2.3 RNA的反转录
                2.2.3 引物的设计与合成
                2.2.4 五种病毒单项PCR反应体系的建立
                2.2.5 多重PCR反应体系的建立
                2.2.6 敏感性试验
                2.2.7 特异性试验
                2.2.8 稳定性试验
                2.2.9 临床样品检测
        3 结果与分析
            3.1 基因组DNA、RNA的检测结果
            3.2 基因同源性分析及引物设计
            3.3 五种病毒单项PCR扩增结果
            3.4 多重PCR扩增结果
            3.5 多重PCR退火温度优化结果
            3.6 敏感性试验
            3.7 特异性试验
            3.8 稳定性试验
            3.9 临床样品检测
        4 结论与讨论
            4.1 关于RNA的提取及反转录
            4.2 引物的设计
            4.3 PCR反应体系的优化
    试验二CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2猪五种繁殖障碍性病毒病联合检测基因芯片诊断方法的建立
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 材料
                2.1.1 毒株来源及病料来源
                2.1.2 主要试剂
                2.1.3 芯片材料
                2.1.4 主要仪器
            2.2 方法
                2.2.1 基因组DNA、RNA的提取
                2.2.2 引物与探针的设计
                2.2.3 引物与探针的合成
                2.2.4 多重PCR制备杂交用PCR产物
                2.2.5 基因芯片的制备
                    2.2.5.1 芯片阵列的设计
                    2.2.5.2 芯片的点样及处理
                    2.2.5.3 基因芯片的杂交
                    2.2.5.4 基因芯片的洗涤与干燥
                    2.2.5.5 基因芯片扫描及扫描结果的分析
                2.2.6 基因芯片制备过程的优化
                    2.2.6.1 寡核苷酸探针合成时间隔臂Poly(dT)有无的选择
                    2.2.6.2 点样及杂交湿度的优化
                    2.2.6.3 探针浓度的选择
                    2.2.6.4 杂交温度的优化
                    2.2.6.5 杂交时间的选择
                2.2.7 基因芯片的特异性试验
                2.2.8 基因芯片的重复性试验
                2.2.9 基因芯片的灵敏性试验
                2.2.10 临床样品检测
        3 结果与分析
            3.1 杂交用PCR产物的制备
            3.2 寡核苷酸探针合成时间隔臂Poly(dT)有无的选择结果
            3.3 点样及杂交湿度的优化结果
            3.4 探针浓度的选择结果
            3.5 杂交温度的优化结果
            3.6 杂交时间的优化结果
            3.7 基因芯片的特异性试验
            3.8 基因芯片的灵敏性试验
            3.9 基因芯片的重复性试验
            3.10 临床样品检测
        4 结论与讨论
            4.1 荧光标记的选择和探针的修饰
            4.2 基因芯片点样过程的优化
            4.3 杂交条件的选择
            4.4 联合检测基因芯片的特异性、灵敏性试验
            4.5 临床样品检测
全文总结
参考文献
英文摘要
发表论文及专利



本文编号：3863454