具有广谱抗ETEC腹泻功能鸡蛋的研制

发布时间：2023-11-18 09:58

　　肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种重要的腹泻致病菌,在发展中国家婴幼儿及到这些国家的旅游者的腹泻疾病中尤为多见。传统临床防治中随着菌株耐药性增强,抗生素的使用效果愈不如人意,而外源提供特异性卵黄抗体具有安全、无抗药性、制备简便等优点,成为一种具有广阔应用前景的抗生素替代品。另一方面在ETEC感染过程中,粘附是致病的首要条件,如何阻断粘附进而防止腹泻的发生是近年来研究的热点。近期研究发现两类非菌毛粘附素即鞭毛蛋白FliC和介导FliC与上皮细胞粘附的EtpA,两者在人源ETEC粘附上皮过程中起重要作用,并且这种新的粘附机制具有一定的普遍性。本研究利用构建的原核表达载体,得到FliC与EtpA蛋白,并在免疫蛋鸡后获得特异性卵黄抗体,并对卵黄抗体体外特性进行研究,通过建立小鼠肠道定植模型,验证IgY的抗粘附效果。旨在为今后广谱性抗ETEC腹泻卵黄抗体的开发与应用奠定基础。结果如下:1.以人源肠毒素大肠杆菌标准株H10407为试验材料,将PCR扩增后的目的片段连接至表达载体,成功构建了在细菌粘附上皮细胞过程中的关键基因etp4和鞭毛基因fliC以及二者融合基因的重组表达质粒,其中融合基因之间以一...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
文献综述
    1 前言
    2 肠毒素大肠杆菌腹泻及其防治
        2.1 肠毒素大肠杆菌生物学特性
        2.2 肠毒素大肠杆菌腹泻的流行病学
        2.3 肠毒素大肠杆菌致病机理
            2.3.1 菌毛粘附素(Fimbrial adhesins)
            2.3.2 非菌毛粘附素(Non-fimbrial adhesins)
            2.3.3 肠毒素
        2.4 肠毒素大肠杆菌腹泻的防治
            2.4.1 肠毒素大肠杆菌的临床症状与鉴定
            2.4.2 防治ETEC腹泻的疫苗研究进展
            2.4.3 临床治疗
    3 卵黄抗体的研究进展
        3.1 发现和发展
        3.2 分子结构
        3.3 生物化学性质
            3.3.1 理化性质
            3.3.2 卵黄抗体的稳定性
            3.3.2 卵黄抗体在应用上的优点
        3.4 分离纯化方法
        3.5 IgY应用的研究进展
            3.5.1 IgY在动物疾病上的研究进展
            3.5.2 IgY在人类食品和医学中的应用
        3.6 制备IgY免疫原的选择
    4 研究目的和意义
试验一 肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白和EtpA的克隆表达
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株和质粒
        2.2 主要仪器设备
        2.3 主要试剂和试剂盒
        2.4 溶液配制
            2.4.1 细菌DNA提取相关溶液
            2.4.2 培养基
            2.4.3 DNA凝胶电泳相关溶液
            2.4.4 SDS-PAGE电泳相关溶液
            2.4.5 包涵体纯化相关试剂
        2.5 实验方法
            2.5.1 细菌DNA的提取
            2.5.2 引物设计
            2.5.3 PCR扩增目的基因
            2.5.4 PCR产物检测与回收
            2.5.5 DNA片段的克隆
            2.5.6 构建表达质粒
            2.5.7 诱导表达
            2.5.8 SDS-PAGE检测蛋白
            2.5.9 包涵体复性
    3 结果与分析
        3.1 PCR扩增目的片段
        3.2 构建目的片段表达载体
        3.3 蛋白的诱导表达及条件优化
            3.3.1 目的蛋白的诱导表达
            3.3.2 目的蛋白的可溶性分析
            3.3.3 目的蛋白诱导表达条件优化
        3.4 包涵体的提取
    4 讨论
        4.1 表达载体的选择
        4.2 基因序列对蛋白表达的影响
        4.3 诱导条件对蛋白表达的影响
    5 小结
试验二 卵黄抗体的制备与稳定性研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 实验动物
        2.2 主要仪器设备
        2.3 试剂
        2.4 溶液配制
            2.4.1 免疫蛋鸡相关试剂
            2.4.2 ELISA相关试剂
            2.4.3 western-blot相关试剂
        2.5 试验方法
            2.5.1 蛋白油乳苗的制备
            2.5.2 免疫蛋鸡
            2.5.3 间接ELISA测定卵黄抗体效价
            2.5.4 western-blot检测蛋白免疫原性
            2.5.5 卵黄抗体的纯化
            2.5.6 制备喷雾干燥全蛋粉
            2.5.7 卵黄抗体的热稳定性研究
            2.5.8 卵黄抗体的酸稳定性研究
            2.5.9 卵黄抗体的酶解稳定性研究
    3 结果与分析
        3.1 最佳抗原包被浓度的确定
        3.2 卵黄抗体效价随时间的变化规律
        3.3 抗融合蛋白卵黄抗体的效价鉴定
        3.4 卵黄抗体的凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分析
        3.5 Western-Blot鉴定卵黄抗体的特异性
        3.6 IgY稳定性研究
            3.6.1 热稳定性
            3.6.2 酸稳定性
            3.6.3 酶解稳定性
    4 讨论
        4.1 卵黄抗体的提纯
        4.2 卵黄抗体在蛋鸡体内产生和发展规律
        4.3 IgY的稳定性研究
    5 小结
试验三 卵黄抗体的抗粘附效果研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 试验动物
        2.2 菌株
        2.3 试验材料
        2.5 方法
            2.5.1 小鼠攻毒试验
            2.5.2 数据分析
    3 结果与分析
    4 讨论
    5 小结
结语
    1 结论
    2 创新点
    3 本研究不足之处
参考文献
致谢



本文编号：3865061